CRISPR-Cas9 چیست؟
CRISPR-Cas9 یکی از مهمترین فناوریهای ویرایش ژنوم است که امکان ایجاد تغییرات هدفمند در DNA سلولها را فراهم میکند. در این سیستم، یک RNA راهنما یا Guide RNA توالی هدف را در ژنوم شناسایی میکند و آنزیم Cas9 در محل مشخصی از DNA برش ایجاد میکند. سپس سیستمهای طبیعی ترمیم DNA در سلول، محل برش را ترمیم میکنند و در جریان این ترمیم میتوان یک ژن را غیرفعال، اصلاح یا توالی جدیدی را وارد ژنوم کرد. این فناوری از یک سیستم دفاعی طبیعی در باکتریها و آرکیها الهام گرفته شده است و امروزه در تحقیقات ژنتیک، بررسی عملکرد ژنها، مدلسازی بیماریها، مهندسی سلول، کشاورزی، توسعه دارو و برخی درمانهای ژنی کاربرد دارد.
CRISPR-Cas9 چیست؟
نحوه عملکرد، کاربردها، مزایا و تفاوت آن با سایر روشهای ویرایش ژن
- CRISPR-Cas9 ابزاری برای ویرایش هدفمند DNA است.
- Guide RNA محل موردنظر را در ژنوم پیدا میکند.
- Cas9 در DNA برش دورشتهای ایجاد میکند.
- ترمیم DNA میتواند باعث حذف، اضافهشدن یا اصلاح توالی شود.
- مهمترین کاربردها شامل Knockout، Knock-in، مدلسازی بیماری و درمانهای ژنی است.
- احتمال Off-Target و تغییرات ناخواسته از محدودیتهای مهم این فناوری است.
CRISPR-Cas9 چیست؟
CRISPR مخفف Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats است و به توالیهای تکرارشوندهای در ژنوم برخی باکتریها و آرکیها اشاره دارد. این میکروارگانیسمها از سیستم CRISPR-Cas بهعنوان نوعی سیستم دفاعی تطبیقی در برابر ویروسها و عناصر ژنتیکی مهاجم استفاده میکنند.
پژوهشگران این سازوکار طبیعی را به ابزاری برای ویرایش ژنوم تبدیل کردهاند. در سیستم مهندسیشده CRISPR-Cas9، یک RNA راهنما محل هدف را مشخص میکند و Cas9 بهعنوان نوکلئاز، DNA را در همان ناحیه برش میدهد.
CRISPR-Cas9 چگونه کار میکند؟
مسیرهای اصلی ترمیم DNA
- اتصال مستقیم دو انتهای شکستهشده
- احتمال ایجاد Indel
- مناسب برای Gene Knockout
- معمولاً بازده بالاتر از HDR
- ترمیم با استفاده از Donor Template
- امکان اصلاح دقیق جهش
- مناسب برای Knock-in
- وابسته به چرخه سلولی و معمولاً کمبازدهتر
اجزای اصلی سیستم CRISPR-Cas9
مراحل انجام CRISPR-Cas9 در آزمایشگاه
انواع ویرایش با CRISPR
- غیرفعالسازی ژن
- ایجاد Frameshift
- افزودن توالی جدید
- Reporter Gene
- Epitope Tag
- اصلاح جهش بیماریزا
- HDR، Base Editing یا Prime Editing
- افزایش بیان ژن
- استفاده از dCas9
- کاهش بیان ژن
- مهار رونویسی
- ویرایش همزمان چند هدف
- مناسب غربالگری ژنومی
Base Editing و Prime Editing
- تغییر برخی بازها بدون شکست کامل دورشتهای
- استفاده از Cas9 Nickase یا dCas9 و Deaminase
- شامل Cytosine و Adenine Base Editor
- استفاده از Cas9 Nickase و Reverse Transcriptase
- هدایت با pegRNA
- مناسب جایگزینی، حذف و اضافهشدنهای کوچک
انواع سیستمهای CRISPR-Cas
کاربردهای CRISPR-Cas9
- Knockout ژن
- مطالعه مسیرهای سلولی
- مدل سلولی
- مدل حیوانی
- بررسی پاسخ به دارو
- ژنهای محرک تومور
- مقاومت دارویی
- مهندسی سلول ایمنی
- Ex Vivo
- In Vivo
- سلولهای T
- سلولهای بنیادی خونساز
- غربالگری ژنومی
- شناسایی اهداف درمانی
- مقاومت به بیماری
- تحمل خشکی
- بهبود محصول
- سامانههای مبتنی بر Cas12
- سامانههای مبتنی بر Cas13
تفاوت CRISPR-Cas9 با RNAi
| ویژگی | CRISPR-Cas9 | RNAi |
|---|---|---|
| مولکول هدف | معمولاً DNA | RNA |
| نوع اثر | تغییر ژنوم | کاهش بیان ژن |
| ماندگاری | میتواند دائمی باشد | معمولاً موقت |
| Knockout | کامل امکانپذیر | معمولاً خیر |
| Off-Target | دارد | دارد |
| کاربرد اصلی | ویرایش ژن | Gene Knockdown |
تفاوت CRISPR با TALEN و ZFN
| ویژگی | CRISPR-Cas9 | TALEN | ZFN |
|---|---|---|---|
| شناسایی هدف | RNA راهنما | پروتئین مهندسیشده | پروتئین Zinc Finger |
| طراحی | نسبتاً ساده | پیچیدهتر | پیچیدهتر |
| هزینه | معمولاً کمتر | بیشتر | بیشتر |
| ویرایش چند هدف | آسانتر | دشوارتر | دشوارتر |
| محدودیت هدفگیری | PAM | ساخت پروتئین | ساخت پروتئین |
| اختصاصیت | وابسته به طراحی | بالا | بالا |
تفاوت CRISPR-Cas9 با NGS
| ویژگی | CRISPR-Cas9 | NGS |
|---|---|---|
| هدف | تغییر DNA | خواندن توالی DNA یا RNA |
| ایجاد تغییر ژنتیکی | دارد | ندارد |
| شناسایی جهش | بهتنهایی محدود | دارد |
| بررسی نتیجه ویرایش | نیازمند روش تأییدی | مناسب برای تأیید |
| کاربرد اصلی | ویرایش ژنوم | توالییابی |
روشهای انتقال CRISPR به سلول
| روش | مزایا | محدودیتها |
|---|---|---|
| Lipofection | ساده و قابلدسترس | برای برخی سلولها کمبازده |
| Electroporation | مناسب بسیاری از سلولها | احتمال کاهش زندهمانی |
| Nucleofection | مناسب سلولهای دشوار | هزینه بیشتر |
| Lentivirus | انتقال پایدار | ادغام در ژنوم و ملاحظات ایمنی |
| AAV | مناسب برخی کاربردهای In Vivo | ظرفیت حمل محدود |
| RNP Delivery | اثر سریع و موقت | نیازمند بهینهسازی انتقال |
| Microinjection | کنترل مستقیم | زمانبر و وابسته به مهارت |
تجهیزات و مواد موردنیاز
مزایا و محدودیتهای CRISPR-Cas9
- طراحی نسبتاً ساده Guide RNA
- امکان هدفگیری دقیق ژنوم
- قابلیت Knockout و Knock-in
- ویرایش همزمان چند ژن
- هزینه کمتر نسبت به روشهای قدیمیتر
- مناسب غربالگری ژنومی
- امکان تنظیم بیان ژن با dCas9
- Off-Target Editing
- تغییرات ناخواسته در محل هدف
- Mosaicism
- بازده پایین HDR
- محدودیت انتقال
- پاسخ ایمنی
- محدودیت PAM
عوامل مؤثر بر کیفیت ویرایش
کاربرد CRISPR در آزمایشگاههای مختلف
| نوع آزمایشگاه | کاربرد |
|---|---|
| ژنتیک مولکولی | ویرایش ژن و بررسی عملکرد واریانتها |
| کشت سلول | تولید رده سلولی ویرایششده |
| تحقیقات سرطان | شناسایی ژنهای مؤثر در تومور |
| ایمونولوژی | مهندسی سلولهای ایمنی |
| داروسازی | غربالگری اهداف دارویی |
| بیوتکنولوژی | تولید پروتئین و بهینهسازی سلول |
| کشاورزی | اصلاح گیاه و دام |
| ژندرمانی | اصلاح یا جبران نقص ژنتیکی |
| تشخیص مولکولی | شناسایی DNA یا RNA هدف |
وکتور چگونه میتواند در اجرای پروژههای CRISPR کمک کند؟
اجرای پروژه CRISPR تنها به خرید Cas9 و Guide RNA محدود نمیشود. نوع سلول، روش انتقال، طراحی آزمایش و روش تأیید نتیجه همگی بر موفقیت پروژه اثر میگذارند.
مشاهده یک باند PCR یا تغییر در Sanger Sequencing بهتنهایی به معنای موفقیت کامل ویرایش نیست. در نمونههای Pool شده، چندین آلل ویرایششده و ویرایشنشده میتوانند همزمان وجود داشته باشند و کروماتوگرام مخلوط ایجاد کنند.
برای تولید یک رده سلولی پایدار، معمولاً لازم است سلولها بهصورت تکسلولی کلون شوند و چندین کلون مستقل در سطح DNA، RNA، پروتئین و عملکرد سلولی بررسی شوند.
ایجاد یک Indel همیشه به معنای Knockout کامل نیست؛ زیرا بعضی Indelها In-Frame هستند. استفاده از بیش از یک Guide RNA مستقل و انجام Rescue Experiment میتواند اعتبار نتایج را افزایش دهد.
ملاحظات اخلاقی و ایمنی
ویرایش ژن سلولهای سوماتیک با ویرایش ژرملاین تفاوت اساسی دارد. تغییرات سوماتیک محدود به فرد درمانشده هستند، اما تغییرات ژرملاین ممکن است به نسلهای بعد منتقل شوند. به همین دلیل، ویرایش ارثپذیر ژنوم انسان با نگرانیهای اخلاقی، ایمنی و اجتماعی جدی همراه است.
برندها و شرکتهای مطرح در حوزه CRISPR
- Thermo Fisher Scientific
- Integrated DNA Technologies
- Synthego
- Merck Sigma-Aldrich
- Takara Bio
- New England Biolabs
- Horizon Discovery
- GenScript
- Addgene
- Lonza
- Thermo Fisher Scientific
- Bio-Rad
- Eppendorf
- MaxCyte
- Celetrix
- CRISPOR
- CHOPCHOP
- Benchling
- CRISPick
- Cas-OFFinder
- ICE Analysis
سؤالات متداول
منابع
- Jinek M, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science
- Anzalone AV, et al. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature Biotechnology
- Redman M, et al. What is CRISPR/Cas9. Archives of Disease in Childhood: Education and Practice Edition
- Guo C, et al. Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing
- Li T, et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal Transduction and Targeted Therapy
- World Health Organization. Human genome editing: recommendations and governance framework