DMSO چیست؟
DMSO یا Dimethyl Sulfoxide (دی‌متیل سولفوکساید) یک حلال آلی قطبی و یکی از پرکاربردترین Cryoprotectantها در کشت سلول است. هنگام انجماد سلول‌ها، تشکیل کریستال‌های یخ و افزایش غلظت مواد محلول می‌تواند به غشا و ساختارهای سلولی آسیب وارد کند. DMSO با نفوذ به سلول و تغییر رفتار آب هنگام انجماد، به کاهش این آسیب کمک می‌کند. در بسیاری از پروتکل‌های Cryopreservation سلول‌های پستانداران، DMSO بخشی از Freezing Medium است. با این حال DMSO در شرایط نامناسب می‌تواند برای سلول سمی باشد؛ بنابراین غلظت، مدت تماس، دما، سرعت انجماد و نحوه Thaw کردن اهمیت زیادی دارند.
DMSO چیست؟
کاربرد دی‌متیل سولفوکساید در فریز و نگهداری سلول‌ها
- DMSO یکی از رایج‌ترین Cryoprotectantها برای فریز کردن سلول‌های پستانداران است.
- این ماده با کاهش آسیب‌های مرتبط با تشکیل یخ و تغییرات اسمزی به حفظ Viability سلول کمک می‌کند.
- در بسیاری از پروتکل‌ها DMSO با غلظت نهایی حدود ۵ تا ۱۰ درصد استفاده می‌شود، اما مقدار مناسب کاملاً به نوع سلول و SOP بستگی دارد.
- DMSO می‌تواند برای سلول‌ها سمی باشد؛ به‌ویژه اگر سلول برای مدت طولانی و در دمای نامناسب در معرض آن قرار گیرد.
- هنگام خرید باید Grade، Purity، Sterility، Water Content، کاربرد Cell Culture/Cryopreservation و Catalog Number دقیقاً بررسی شوند.
DMSO چیست؟
DMSO با فرمول شیمیایی (CH₃)₂SO یک ترکیب آلی گوگرددار است که به شکل مایع بی‌رنگ دیده می‌شود.
نام کامل آن:
Dimethyl Sulfoxide
است.
DMSO یک حلال Polar Aprotic محسوب می‌شود و قابلیت حل کردن طیف وسیعی از ترکیبات قطبی و غیرقطبی را دارد.
این ویژگی باعث شده DMSO علاوه بر Cryopreservation، در بسیاری از آزمایش‌های زیستی به‌عنوان Solvent نیز استفاده شود.
دو کاربرد بسیار مهم آن در آزمایشگاه عبارت‌اند از:
Cryopreservation چیست؟
Cryopreservation به نگهداری سلول‌ها، بافت‌ها یا سایر مواد زیستی در دماهای بسیار پایین گفته می‌شود.
هدف این است که فعالیت‌های متابولیکی و فرآیندهای تخریبی تا حد بسیار زیادی کاهش پیدا کنند و نمونه برای مدت طولانی قابل نگهداری باشد.
در Cell Culture، Cryopreservation امکان ایجاد Cell Bank را فراهم می‌کند.
برای مثال می‌توان یک Cell Line سالم با Passage Number مناسب را فریز کرد و در آینده دوباره مورد استفاده قرار داد.
چرا نمی‌توان سلول را مستقیماً فریز کرد؟
سلول‌ها حاوی مقدار زیادی آب هستند.
اگر Cell Suspension بدون Cryoprotection مناسب منجمد شود، چند فرآیند می‌توانند به سلول آسیب وارد کنند:
بنابراین انجماد سلول یک فرآیند کنترل‌شده است و صرفاً قرار دادن Tube در فریزر به معنی Cryopreservation صحیح نیست.
DMSO چگونه از سلول محافظت می‌کند؟
DMSO در گروه Penetrating Cryoprotectants قرار می‌گیرد.
این ماده می‌تواند از غشای سلولی عبور کند و بر رفتار آب در داخل و خارج سلول اثر بگذارد.
در یک Cryopreservation مناسب، DMSO به کاهش آسیب ناشی از:
کمک می‌کند.
اما DMSO به‌تنهایی کافی نیست.
کیفیت Cryopreservation نتیجه تعامل چند عامل است:
Cryoprotectant چیست؟
Cryoprotectant ماده‌ای است که برای کاهش آسیب ناشی از انجماد و ذوب نمونه‌های زیستی استفاده می‌شود.
Cryoprotectantها را می‌توان به دو گروه کلی تقسیم کرد:
Cryoprotectantهای نفوذپذیر
مانند:
Cryoprotectantهای غیرنفوذپذیر
مانند برخی:
DMSO یکی از شناخته‌شده‌ترین Cryoprotectantهای نفوذپذیر برای سلول‌های پستانداران است.
DMSO در Cell Freezing Medium چه نقشی دارد؟
Freezing Medium معمولاً فقط از DMSO تشکیل نشده است.
بسته به Cell Type و پروتکل، ممکن است ترکیبی از:
یا یک Serum-Free Commercial Freezing Medium استفاده شود.
DMSO در این ترکیب نقش Cryoprotectant اصلی را ایفا می‌کند.
فرمولاسیون دقیق Freezing Medium باید برای Cell Line موردنظر Validate شده باشد.
چه غلظتی از DMSO برای فریز سلول استفاده می‌شود؟
در بسیاری از پروتکل‌های سلول‌های پستانداران، غلظت نهایی DMSO در محدوده:
۵ تا ۱۰ درصد
قرار دارد و ۱۰% DMSO یکی از فرمولاسیون‌های بسیار رایج است.
اما این عدد یک قانون جهانی نیست.
غلظت مناسب به عواملی مانند:
بستگی دارد.
در نتیجه پروتکل معتبر همان سلول باید مبنای کار قرار گیرد.
چرا DMSO برای سلول سمی است؟
یکی از تناقض‌های مهم DMSO این است که هنگام انجماد از سلول محافظت می‌کند، اما در شرایط نامناسب می‌تواند به سلول آسیب برساند.
اثرات DMSO وابسته به:
هستند.
به همین دلیل معمولاً تلاش می‌شود زمان قرار گرفتن سلول‌ها در معرض غلظت Cryopreservation از DMSO در دماهای بالاتر، غیرضروری طولانی نشود.
چرا دما در سمیت DMSO اهمیت دارد؟
سمیت DMSO معمولاً با افزایش مدت تماس و دما اهمیت بیشتری پیدا می‌کند.
به همین دلیل مراحل آماده‌سازی Cell Suspension، افزودن Freezing Medium، انجماد و همچنین Thaw کردن باید با برنامه مشخص انجام شوند.
پس از Thaw نیز در بسیاری از پروتکل‌ها DMSO با انتقال سلول‌ها به محیط کشت مناسب رقیق یا حذف می‌شود.
روش دقیق به Cell Type بستگی دارد.
مراحل کلی Cryopreservation سلول
پروتکل دقیق برای هر Cell Type متفاوت است، اما فرآیند کلی می‌تواند شامل موارد زیر باشد:
ثبت دقیق اطلاعات نمونه در تمام مراحل اهمیت زیادی دارد.
چرا سرعت انجماد اهمیت دارد؟
اگر سلول خیلی سریع یا خیلی آهسته منجمد شود، ممکن است آسیب افزایش پیدا کند.
در بسیاری از پروتکل‌های سلول‌های پستانداران از Controlled-Rate Freezing یا سیستم‌هایی استفاده می‌شود که سرعت کاهش دما را تقریباً کنترل می‌کنند.
یک نرخ نزدیک به:
۱°C در دقیقه
در بسیاری از پروتکل‌ها رایج است، اما این مقدار نیز برای تمام سلول‌ها قانون ثابت نیست.
هدف ایجاد تعادل بین:
است.
Freezing Container چیست؟
برای آزمایشگاه‌هایی که Controlled-Rate Freezer ندارند، ظروف مخصوص انجماد سلول وجود دارند که برای ایجاد Cooling Rate نسبتاً کنترل‌شده طراحی شده‌اند.
Cryovialها در این Containerها قرار گرفته و طبق دستورالعمل سیستم وارد Freezer می‌شوند.
بعد از مرحله Pre-freezing، ویال‌ها برای نگهداری طولانی‌مدت به سیستم Cryogenic منتقل می‌شوند.
نگهداری سلول در نیتروژن مایع
برای نگهداری طولانی‌مدت Cell Bank معمولاً از شرایط Cryogenic استفاده می‌شود.
Liquid Nitrogen دمای بسیار پایینی فراهم می‌کند و فعالیت‌های بیولوژیکی را تا حد بسیار زیادی متوقف می‌کند.
در Cell Banking علاوه بر دما، موارد زیر نیز اهمیت دارند:
یک Cell Bank بدون سیستم ثبت اطلاعات مناسب می‌تواند در آینده منبع خطا باشد.
Master Cell Bank و Working Cell Bank چیست؟
در آزمایشگاه‌هایی که Cell Culture به‌صورت منظم انجام می‌شود، بهتر است بانک سلولی ساختارمند باشد.
Master Cell Bank
مجموعه‌ای از ویال‌های سلولی با ویژگی‌های مشخص که به‌عنوان منبع اصلی نگهداری می‌شوند.
Working Cell Bank
ویال‌هایی که از بانک اصلی تهیه شده‌اند و برای کارهای روزمره آزمایشگاه مورد استفاده قرار می‌گیرند.
این ساختار می‌تواند از افزایش غیرضروری Passage Number و تغییرات تدریجی Cell Line جلوگیری کند.
Thawing سلول چیست؟
Thawing فرآیند خارج کردن Cell Stock از شرایط انجماد و بازگرداندن سلول‌ها به شرایط کشت است.
این مرحله به اندازه Freezing اهمیت دارد.
Thaw نامناسب می‌تواند باعث کاهش Viability شود حتی اگر Freezing اولیه به‌درستی انجام شده باشد.
چرا Thawing معمولاً سریع انجام می‌شود؟
در بسیاری از پروتکل‌ها توصیه می‌شود ویال سلولی نسبتاً سریع Thaw شود.
هدف کاهش مدت زمانی است که سلول در شرایط نامناسب بین Frozen و Fully Thawed قرار دارد.
پس از Thaw، DMSO نیز باید طبق پروتکل مناسب سلول رقیق یا حذف شود.
DMSO بعد از Thaw چگونه حذف می‌شود؟
روش دقیق به Cell Type و SOP بستگی دارد.
در برخی پروتکل‌ها Cell Suspension به محیط کشت اضافه و DMSO رقیق می‌شود.
در برخی دیگر ممکن است مرحله Centrifugation برای حذف Freezing Medium انجام شود.
نکته مهم این است که Centrifugation پس از Thaw برای تمام Cell Typeها الزاماً بهترین روش نیست و باید بر اساس پروتکل معتبر تصمیم‌گیری شود.
بررسی Viability بعد از Thaw
بعد از Thaw می‌توان Cell Viability را بررسی کرد.
یکی از روش‌های ساده:
Trypan Blue Exclusion
است.
به این ترتیب دو ماده‌ای که در مقالات قبلی بررسی کردیم مستقیماً به یکدیگر مرتبط می‌شوند:
اما فقط Viability لحظه‌ای کافی نیست.
توانایی سلول برای:
پس از Thaw نیز اهمیت دارد.
تفاوت DMSO و Glycerol چیست؟
هر دو می‌توانند به‌عنوان Cryoprotectant استفاده شوند، اما کاربرد آن‌ها در سیستم‌های مختلف متفاوت است.
| ویژگی | DMSO | Glycerol |
|---|---|---|
| Cryoprotectant | بله | بله |
| نفوذ به سلول | بالا | دارد |
| کشت سلول پستانداران | بسیار رایج | کاربرد محدودتر نسبت به DMSO |
| Microbial Cryopreservation | قابل استفاده | بسیار رایج |
| سمیت وابسته به زمان/دما | مهم | متفاوت |
| انتخاب | وابسته به Cell Type | وابسته به سیستم |
برای بسیاری از Mammalian Cell Lineها، DMSO گزینه رایج‌تری است.
DMSO به‌عنوان Solvent
کاربرد DMSO محدود به Cryopreservation نیست.
در مطالعات:
از DMSO برای حل کردن ترکیباتی استفاده می‌شود که در آب حلالیت کمی دارند.
برای مثال یک Drug ممکن است ابتدا در DMSO حل و سپس به محیط کشت اضافه شود.
چرا غلظت DMSO در آزمایش‌های دارویی مهم است؟
DMSO خودش می‌تواند روی سلول اثر بگذارد.
بنابراین اگر Compound در DMSO حل شده باشد، غلظت نهایی DMSO در محیط آزمایش باید کنترل شود.
یکی از اصول مهم طراحی چنین آزمایش‌هایی استفاده از:
Vehicle Control
است.
در Vehicle Control، سلول‌ها همان مقدار DMSO را دریافت می‌کنند اما Compound مورد مطالعه وجود ندارد.
به این ترتیب می‌توان اثر خود DMSO را از اثر Drug جدا کرد.
آیا DMSO می‌تواند روی بیان ژن اثر بگذارد؟
بله. بسته به غلظت، مدت تماس و Cell Type، DMSO می‌تواند بر:
اثر بگذارد.
بنابراین نباید DMSO را صرفاً یک حلال کاملاً خنثی در نظر گرفت.
DMSO Grade چیست؟
DMSO با Gradeهای مختلف عرضه می‌شود.
برای کاربردهای Cell Culture و Cryopreservation باید محصولی انتخاب شود که مشخصات آن برای کاربرد موردنظر مناسب باشد.
ممکن است در بازار عناوینی مانند:
دیده شوند.
این Gradeها الزاماً قابل جایگزینی با یکدیگر نیستند.
چرا خلوص DMSO مهم است؟
DMSO می‌تواند به‌عنوان حلال و Cryoprotectant مستقیماً با سلول تماس داشته باشد.
بنابراین وجود ناخالصی‌ها می‌تواند روی:
اثر بگذارد.
برای کاربردهای حساس، Specification و Certificate of Analysis محصول باید بررسی شود.
چرا Water Content در DMSO اهمیت دارد؟
DMSO یک ماده Hygroscopic است؛ یعنی می‌تواند رطوبت محیط را جذب کند.
در نتیجه باز و بسته شدن مکرر ظرف یا نگهداری نامناسب ممکن است مقدار آب محصول را تغییر دهد.
برای کاربردهای حساس باید به شرایط نگهداری و Handling محصول توجه شود.
شرایط نگهداری DMSO
شرایط دقیق نگهداری باید از Datasheet همان محصول بررسی شود.
موارد مهم عبارت‌اند از:
DMSO دارای نقطه ذوب نسبتاً بالایی برای یک حلال آزمایشگاهی است و ممکن است در دمای نسبتاً خنک کریستالیزه یا جامد شود.
این اتفاق الزاماً به معنی خراب شدن محصول نیست و باید دستورالعمل سازنده برای Liquefaction بررسی شود.
آیا DMSO استریل است؟
همه DMSOهای موجود در بازار الزاماً Sterile نیستند.
اگر قرار است محصول مستقیماً در Cell Culture یا Cryopreservation استفاده شود، وضعیت:
Sterility
باید بررسی شود.
نباید صرفاً از روی خلوص شیمیایی نتیجه گرفت که محصول برای Cell Culture مناسب است.
تفاوت DMSO معمولی و Cell Culture Grade چیست؟
DMSO آزمایشگاهی عمومی ممکن است از نظر خلوص شیمیایی مناسب باشد، اما محصول Cell Culture Grade معمولاً برای کاربردهای زیستی مشخصات و کنترل‌های مرتبط‌تری دارد.
هنگام انتخاب بهتر است موارد زیر بررسی شوند:
| مشخصه | DMSO عمومی | Cell Culture Grade |
|---|---|---|
| کاربرد شیمیایی | بله | بله |
| کاربرد Cell Culture | الزاماً خیر | طراحی‌شده/تست‌شده برای این کاربرد |
| Sterility | متغیر | بسته به محصول |
| Biological Testing | متغیر | ممکن است انجام شده باشد |
| Documentation | متفاوت | معمولاً مرتبط‌تر با Cell Culture |
بنابراین Catalog Number اهمیت زیادی دارد.
DMSO و Stem Cell
DMSO در Cryopreservation بسیاری از Stem Cellها نیز کاربرد دارد.
اما Stem Cellها می‌توانند نسبت به:
حساس باشند.
در این موارد استفاده از یک پروتکل Validate شده اهمیت بیشتری پیدا می‌کند.
همچنین Freezing Mediumهای آماده مخصوص Stem Cell نیز وجود دارند.
DMSO و Primary Cell
Primary Cellها نیز ممکن است برای Cryopreservation به DMSO نیاز داشته باشند، اما پاسخ آن‌ها به انجماد می‌تواند با Established Cell Lineها متفاوت باشد.
در Primary Cell Culture باید عواملی مانند:
به‌طور دقیق‌تر کنترل شوند.
DMSO و Cell Lineهای سرطانی
DMSO در Cryopreservation بسیاری از Cancer Cell Lineها استفاده می‌شود.
اما مقدار DMSO و Freezing Medium باید بر اساس پروتکل همان Cell Line انتخاب شود.
برای Cell Lineهای استاندارد بهتر است اطلاعات:
بررسی شود.
عوامل مؤثر بر موفقیت Cryopreservation
موفقیت فریز سلول فقط به DMSO وابسته نیست.
عوامل مهم عبارت‌اند از:
ضعف در هر کدام از این مراحل می‌تواند Post-thaw Recovery را کاهش دهد.
مزایا و محدودیت‌ها
- یکی از پرکاربردترین Cryoprotectantهای سلول‌های پستانداران
- قابلیت نفوذ به سلول
- کاهش آسیب ناشی از Cryopreservation
- قابل استفاده برای طیف گسترده‌ای از Cell Lineها
- کاربرد در Primary Cell و Stem Cell با پروتکل مناسب
- کاربرد به‌عنوان Solvent در تحقیقات سلولی
- دسترسی گسترده به محصولات Cell Culture Grade
- در شرایط نامناسب می‌تواند برای سلول سمی باشد.
- سمیت آن به غلظت، زمان و دما وابسته است.
- برای همه Cell Typeها یک غلظت ثابت قابل توصیه نیست.
- می‌تواند بر Gene Expression و رفتار سلولی اثر بگذارد.
- رطوبت را جذب می‌کند و Handling مناسب اهمیت دارد.
- تمام DMSOهای آزمایشگاهی برای Cell Culture مناسب نیستند.
- موفقیت Cryopreservation فقط با اضافه کردن DMSO تضمین نمی‌شود.
برندهای مطرح DMSO
برخی تولیدکنندگان شناخته‌شده محصولات مناسب تحقیقات زیستی و Cell Culture عبارت‌اند از:
برای انتخاب محصول، Grade و Catalog Number مهم‌تر از صرفاً نام برند هستند.
هنگام خرید DMSO به چه نکاتی توجه کنیم؟
برای سفارش DMSO بهتر است موارد زیر مشخص شوند:
برای مثال درخواست:
DMSO – Cell Culture Grade – Sterile – Suitable for Cryopreservation – Brand/Catalog Number
بسیار دقیق‌تر از نوشتن صرفاً «DMSO» است.
وکتور چگونه می‌تواند در تأمین DMSO کمک کند؟
در وکتور می‌توان درخواست DMSO را با مشخصات دقیق مانند:
ثبت کرد.
سپس پیشنهاد تأمین‌کنندگان مختلف را از نظر:
مقایسه کرد.
این موضوع برای DMSO اهمیت ویژه‌ای دارد؛ زیرا دو محصول که هر دو با عنوان DMSO فروخته می‌شوند ممکن است برای کاربردهای کاملاً متفاوتی تولید شده باشند.
همچنین در یک استعلام Cryopreservation می‌توان اقلام مرتبط مانند Cryovial، Freezing Medium، FBS و سایر مواد مصرفی Cell Culture را نیز مشخص کرد.
یکی از اشتباهات رایج در Cryopreservation این است که وقتی Viability بعد از Thaw پایین است، تمام مشکل به کیفیت DMSO نسبت داده شود.
در حالی که بهتر است کل زنجیره بررسی شود:
برای مثال حتی با DMSO مناسب، اگر سلول قبل از Freeze وضعیت خوبی نداشته باشد یا Cooling Rate نامناسب باشد، Post-thaw Recovery می‌تواند ضعیف باشد.
نکته دیگر اینکه Viability بالا بلافاصله پس از Thaw الزاماً به معنی Cryopreservation موفق نیست. بهتر است Attachment، Morphology و Proliferation سلول نیز طی دوره Recovery بررسی شوند.
در مطالعات حساس نیز ثبت برند، Catalog Number و Lot Number DMSO می‌تواند در بررسی اختلاف بین Batchهای مختلف مفید باشد.
سؤالات متداول
منابع
- Freshney RI. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications
- ATCC. Animal Cell Culture Guide – Cryopreservation of Cell Lines
- Baust JM, Van Buskirk R, Baust JG. Cell viability improves following inhibition of cryopreservation-induced apoptosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology
- Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. American Journal of Physiology
- Pegg DE. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology
- Thermo Fisher Scientific / Gibco. Cell Culture Cryopreservation Technical Resources
- Merck / Sigma-Aldrich. DMSO Cell Culture and Cryopreservation Technical Documentation
- Current Protocols in Cell Biology. Cryopreservation of Mammalian Cells