L-Glutamine چیست؟
L-Glutamine یا ال-گلوتامین یکی از مهم‌ترین اسیدهای آمینه مورد استفاده در محیط‌های کشت سلولی است و برای بسیاری از سلول‌های پستانداران نقش مهمی در تولید انرژی، تأمین نیتروژن، سنتز پروتئین و نوکلئوتیدها و رشد سلولی دارد. بسیاری از محیط‌های رایج مانند DMEM و RPMI 1640 در انواع With L-Glutamine و Without L-Glutamine عرضه می‌شوند. نکته مهم این است که L-Glutamine در محلول نسبتاً ناپایدار است و به‌مرور تجزیه شده و می‌تواند ترکیباتی از جمله آمونیاک ایجاد کند. به همین دلیل جایگزین‌های پایدارتر مانند L-alanyl-L-glutamine که در محصولاتی مانند GlutaMAX استفاده می‌شوند، در بسیاری از سیستم‌های کشت سلولی کاربرد پیدا کرده‌اند.
HEPES چیست؟
کاربرد بافر HEPES در کشت سلول و کنترل pH محیط کشت
- HEPES یک Biological Buffer برای کمک به ثابت نگه داشتن pH محیط کشت است.
- در محدوده نزدیک به pH فیزیولوژیک عملکرد بافری مناسبی دارد.
- استفاده از HEPES هنگام Manipulation سلول خارج از CO₂ Incubator می‌تواند مفید باشد.
- HEPES جایگزین مطلق سیستم Bicarbonate/CO₂ نیست و معمولاً به‌عنوان سیستم بافری مکمل استفاده می‌شود.
- هنگام خرید باید به Concentration، Sterility، Cell Culture Grade، شکل شیمیایی، حجم و Catalog Number توجه شود.
HEPES چیست؟
HEPES مخفف:
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
است.
این ترکیب در گروه Good’s Buffers قرار دارد؛ گروهی از بافرها که برای کاربردهای بیولوژیک طراحی شده‌اند.
HEPES به دلیل عملکرد مناسب در محدوده pH نزدیک به شرایط فیزیولوژیک، در بسیاری از:
کاربرد دارد.
یکی از مهم‌ترین کاربردهای آن در Cell Culture، افزایش توانایی محیط برای مقاومت در برابر تغییرات pH است.
بافر چیست؟
Buffer محلولی است که در برابر تغییرات pH ناشی از اضافه شدن مقادیر محدود اسید یا باز مقاومت می‌کند.
در سیستم‌های بیولوژیک این موضوع اهمیت زیادی دارد، زیرا بسیاری از فرآیندهای سلولی به pH حساس هستند.
تغییر pH می‌تواند روی:
اثر بگذارد.
بنابراین محیط کشت باید دارای سیستم بافری مناسب باشد.
HEPES چگونه عمل می‌کند؟
HEPES یک سیستم اسید-باز ضعیف ایجاد می‌کند که می‌تواند در برابر تغییرات غلظت یون H⁺ مقاومت کند.
وقتی محیط تمایل به اسیدی یا قلیایی شدن دارد، تعادل بین فرم‌های پروتونه و دپروتونه HEPES بخشی از این تغییر را جذب می‌کند.
نتیجه این است که pH نسبت به یک محیط بدون Buffer مناسب، پایدارتر باقی می‌ماند.
محدوده بافری HEPES چقدر است؟
HEPES دارای pKa حدود 7.5 در دمای اتاق است و در محدوده‌ای تقریباً نزدیک به:
pH 6.8 تا 8.2
ظرفیت بافری مناسبی دارد.
این محدوده با بسیاری از کاربردهای بیولوژیک هم‌پوشانی دارد.
به همین دلیل HEPES برای محیط‌هایی که باید نزدیک pH فیزیولوژیک باقی بمانند، گزینه مناسبی محسوب می‌شود.
البته pKa با دما تغییر می‌کند و این موضوع در آزمایش‌های دقیق باید مورد توجه قرار گیرد.
چرا کنترل pH در Cell Culture مهم است؟
سلول‌های پستانداران معمولاً در محدوده نسبتاً محدودی از pH بهترین عملکرد را دارند.
تغییر زیاد pH می‌تواند باعث:
شود.
بنابراین کنترل pH یکی از پارامترهای اصلی کیفیت Cell Culture است.
سیستم Bicarbonate/CO₂ چیست؟
بسیاری از محیط‌های Cell Culture از Sodium Bicarbonate به‌عنوان بخشی از سیستم بافری استفاده می‌کنند.
این سیستم با CO₂ موجود در Incubator در تعادل قرار می‌گیرد.
به‌صورت ساده:
تعادل میان CO₂، Carbonic Acid و Bicarbonate به تنظیم pH کمک می‌کند.
به همین دلیل درصد CO₂ انکوباتور باید با میزان Bicarbonate موجود در محیط هماهنگ باشد.
مشکل سیستم Bicarbonate/CO₂ خارج از انکوباتور چیست؟
وقتی ظرف Cell Culture از CO₂ Incubator خارج می‌شود، شرایط CO₂ اطراف محیط تغییر می‌کند.
در نتیجه تعادل Bicarbonate/CO₂ نیز تغییر کرده و pH ممکن است به‌تدریج از محدوده مطلوب خارج شود.
این مسئله هنگام:
که سلول برای مدتی خارج از Incubator باقی می‌ماند، اهمیت بیشتری پیدا می‌کند.
HEPES می‌تواند در چنین شرایطی Buffering اضافی ایجاد کند.
HEPES چه ارتباطی با CO₂ Incubator دارد؟
HEPES نسبت به سیستم Bicarbonate وابستگی مستقیم کمتری به CO₂ محیط دارد.
بنابراین اضافه شدن HEPES می‌تواند باعث شود محیط هنگام خارج بودن از Incubator مقاومت بیشتری در برابر تغییر سریع pH داشته باشد.
اما این موضوع به معنی بی‌نیاز شدن کامل از CO₂ Incubator نیست.
در بسیاری از محیط‌ها:
به‌صورت مکمل عمل می‌کنند.
آیا HEPES جایگزین Sodium Bicarbonate است؟
الزاماً خیر.
این دو سیستم ویژگی‌های متفاوتی دارند.
| ویژگی | HEPES | Bicarbonate/CO₂ |
|---|---|---|
| نوع | Organic Buffer | Physiological Buffer System |
| وابستگی به CO₂ | کم | زیاد |
| عملکرد خارج از Incubator | مناسب‌تر | محدودتر |
| استفاده در Cell Culture | رایج | بسیار رایج |
| نیاز به CO₂ Incubator | به‌تنهایی الزاماً نه | معمولاً بله |
| استفاده هم‌زمان | امکان‌پذیر | امکان‌پذیر |
در بسیاری از محیط‌های Cell Culture هر دو سیستم حضور دارند.
HEPES در چه محیط‌های کشتی استفاده می‌شود؟
HEPES می‌تواند در انواع مختلف محیط‌های Cell Culture استفاده شود.
از جمله:
اما تمام فرمولاسیون‌های این محیط‌ها HEPES ندارند.
برای مثال ممکن است یک شرکت چند نوع RPMI 1640 ارائه کند:
بنابراین بررسی Composition و Catalog Number ضروری است.
HEPES در RPMI 1640
RPMI 1640 یکی از محیط‌هایی است که در برخی فرمولاسیون‌های آن HEPES وجود دارد.
این موضوع به‌ویژه برای کاربردهایی که سلول مدت بیشتری خارج از Incubator Manipulate می‌شود می‌تواند مفید باشد.
با این حال RPMI حاوی HEPES با RPMI بدون HEPES یک محصول کاملاً یکسان نیست.
بنابراین در مطالعات حساس نباید بدون بررسی جایگزین شوند.
HEPES در DMEM
DMEM نیز در فرمولاسیون‌های مختلف عرضه می‌شود.
برخی محصولات DMEM دارای HEPES هستند و بسیاری نیز فاقد آن هستند.
اگر آزمایشگاه قصد اضافه کردن HEPES جداگانه را دارد، ابتدا باید بررسی شود که محیط پایه از قبل HEPES دارد یا خیر.
این موضوع از اضافه شدن غیرضروری Buffer جلوگیری می‌کند.
چه غلظتی از HEPES در Cell Culture استفاده می‌شود؟
غلظت مناسب HEPES به:
وابسته است.
در بسیاری از کاربردهای Cell Culture، غلظت‌های نهایی در محدوده تقریبی:
۱۰ تا ۲۵ میلی‌مولار
رایج هستند و در برخی پروتکل‌ها غلظت‌های دیگری نیز استفاده می‌شوند.
بنابراین یک غلظت واحد نباید برای تمام Cell Lineها در نظر گرفته شود.
HEPES 1M چیست؟
HEPES برای Cell Culture می‌تواند به‌صورت محلول Concentrated مانند:
HEPES Buffer Solution 1 M
عرضه شود.
این محلول معمولاً به محیط پایه اضافه می‌شود تا غلظت نهایی موردنظر ایجاد شود.
اگر از Stock Solution استفاده می‌شود، محاسبه Dilution باید دقیق باشد.
همچنین Sterility و Grade محصول باید برای Cell Culture مناسب باشد.
آیا می‌توان HEPES را مستقیماً به محیط کشت اضافه کرد؟
در صورت استفاده از محصول مناسب و وجود پروتکل معتبر، HEPES می‌تواند به محیط اضافه شود.
اما قبل از آن باید مشخص شود:
اضافه کردن Buffer بدون بررسی Composition محیط می‌تواند شرایط آزمایش را تغییر دهد.
HEPES و Phenol Red
Phenol Red و HEPES نقش یکسانی ندارند.
Phenol Red تغییر pH را با تغییر رنگ نشان می‌دهد، اما HEPES به مقاومت محیط در برابر تغییر pH کمک می‌کند.
بنابراین وجود Phenol Red به معنی Buffering مناسب نیست.
تغییر رنگ محیط کشت چه ارتباطی با pH دارد؟
در محیط‌های دارای Phenol Red، رنگ محیط می‌تواند اطلاعات اولیه‌ای درباره pH بدهد.
تغییر رنگ شدید ممکن است با:
مرتبط باشد.
HEPES می‌تواند برخی تغییرات سریع pH را کاهش دهد، اما نمی‌تواند علت اصلی مشکلاتی مانند آلودگی یا Overgrowth را برطرف کند.
HEPES در Microscopy و Live Cell Imaging
یکی از کاربردهای مهم HEPES در آزمایش‌هایی است که سلول برای مدتی خارج از CO₂ Incubator قرار دارد.
برای مثال:
اگر Stage Incubator با کنترل CO₂ در دسترس نباشد، Buffering مستقل‌تر از CO₂ می‌تواند اهمیت بیشتری پیدا کند.
البته دما نیز باید هم‌زمان کنترل شود.
آیا HEPES روی سلول اثر دارد؟
HEPES در غلظت‌های مناسب برای بسیاری از Cell Lineها به‌خوبی تحمل می‌شود.
اما هیچ Bufferی را نباید کاملاً بی‌اثر در نظر گرفت.
غلظت بالا یا شرایط نامناسب می‌تواند:
را تغییر دهد.
به همین دلیل اگر HEPES بخشی از یک پروتکل استاندارد نیست، اضافه کردن آن باید با توجه به Cell Type و هدف آزمایش انجام شود.
HEPES و نور
یکی از نکات مهم درباره HEPES، شرایط نوری است.
مطالعات کلاسیک نشان داده‌اند که محیط‌های حاوی HEPES تحت برخی شرایط نوری می‌توانند با تشکیل Reactive Oxygen Species، به‌ویژه Hydrogen Peroxide همراه شوند.
این مسئله می‌تواند در برخی شرایط باعث Phototoxicity شود.
بنابراین در آزمایش‌هایی که سلول‌ها برای مدت طولانی در معرض نور شدید قرار دارند، این موضوع اهمیت بیشتری پیدا می‌کند.
HEPES و Live Cell Imaging طولانی‌مدت
اگر قرار است Live Cell Imaging برای مدت طولانی انجام شود، فقط اضافه کردن HEPES کافی نیست.
باید هم‌زمان:
کنترل شوند.
در Imagingهای طولانی استفاده از سیستم‌های Stage-top Incubator می‌تواند شرایط پایدارتر و فیزیولوژیک‌تری ایجاد کند.
آیا HEPES باعث تولید ROS می‌شود؟
HEPES به‌خودی‌خود به این معنی نیست که محیط الزاماً برای سلول مضر است.
اما تحت برخی شرایط، به‌خصوص در حضور نور و بعضی اجزای محیط، تشکیل Reactive Oxygen Species گزارش شده است.
بنابراین این مسئله بیشتر در:
اهمیت پیدا می‌کند.
HEPES و دما
pKa بافرها با دما تغییر می‌کند.
HEPES نیز از این قاعده مستثنا نیست.
بنابراین pH محلولی که در دمای اتاق اندازه‌گیری می‌شود ممکن است دقیقاً با pH همان محلول در ۳۷°C برابر نباشد.
در آزمایش‌های حساس باید Temperature Dependency سیستم بافری در نظر گرفته شود.
HEPES در کشت سلول‌های Suspension
HEPES فقط برای Adherent Cells استفاده نمی‌شود.
در برخی کشت‌های Suspension نیز می‌تواند برای افزایش ثبات pH مورد استفاده قرار گیرد.
برای مثال برخی فرمولاسیون‌های RPMI حاوی HEPES برای کشت سلول‌های:
استفاده می‌شوند.
اما انتخاب محیط همچنان باید بر اساس پروتکل همان سلول انجام شود.
HEPES در کشت لنفوسیت
در کشت لنفوسیت، به‌خصوص زمانی که محیط خارج از Incubator Manipulate می‌شود، HEPES می‌تواند به حفظ pH کمک کند.
با این حال برای کشت‌های Cytogenetic، وجود HEPES یک الزام جهانی نیست و محیط‌های مختلف ممکن است سیستم‌های بافری متفاوتی داشته باشند.
بنابراین بهتر است فرمولاسیون محیط مورد استفاده در SOP آزمایشگاه ثابت و Validate شده باشد.
HEPES در کاریوتایپ
در کشت سلولی برای Karyotyping، عواملی مانند:
روی کیفیت Culture اثر دارند.
HEPES می‌تواند بخشی از سیستم کنترل pH باشد، اما اضافه کردن آن به یک پروتکل Cytogenetic تثبیت‌شده بدون Validation مناسب توصیه نمی‌شود.
در این کاربرد ثبات شرایط بین Batchها اهمیت بیشتری از اضافه کردن غیرضروری Supplement دارد.
تفاوت HEPES و PBS چیست؟
HEPES و PBS هر دو می‌توانند نقش بافری داشته باشند، اما کاربرد آن‌ها یکسان نیست.
| ویژگی | HEPES | PBS |
|---|---|---|
| نوع | Organic Buffer | Phosphate Buffer |
| استفاده داخل Medium | رایج | معمولاً خیر |
| شست‌وشوی سلول | معمولاً کاربرد اصلی نیست | بسیار رایج |
| کنترل pH محیط کشت | بله | کاربرد اصلی نیست |
| Cell Washing | محدود | بسیار رایج |
بنابراین PBS جایگزین HEPES در محیط کشت محسوب نمی‌شود.
تفاوت HEPES و Tris چیست؟
هر دو Buffer هستند، اما خصوصیات متفاوتی دارند.
HEPES برای بسیاری از سیستم‌های Cell Culture مناسب‌تر است، در حالی که Tris در بسیاری از کاربردهای:
بسیار رایج است.
انتخاب Buffer باید بر اساس pH هدف، دما و کاربرد انجام شود.
مزایا و محدودیت‌ها
- ظرفیت بافری مناسب نزدیک pH فیزیولوژیک
- وابستگی کمتر به CO₂ نسبت به سیستم Bicarbonate
- مفید هنگام Manipulation خارج از Incubator
- کاربرد گسترده در Cell Culture
- مناسب برای بسیاری از Live Cell Experiments
- قابل تهیه به‌صورت محلول آماده و Concentrated
- موجود در فرمولاسیون برخی محیط‌های آماده
- برای تمام Cell Lineها ضروری نیست.
- جایگزین مطلق سیستم Bicarbonate/CO₂ نیست.
- غلظت نامناسب می‌تواند شرایط محیط را تغییر دهد.
- در برخی شرایط نوری می‌تواند با Phototoxicity و ROS مرتبط باشد.
- pKa آن با دما تغییر می‌کند.
- اضافه کردن آن به محیطی که از قبل HEPES دارد می‌تواند باعث خطای فرمولاسیون شود.
- تغییر سیستم بافری در آزمایش‌های حساس نیازمند Validation است.
شرایط نگهداری HEPES
شرایط نگهداری به شکل محصول و شرکت سازنده بستگی دارد.
HEPES ممکن است به‌صورت:
عرضه شود.
مواردی که باید بررسی شوند:
دستورالعمل Datasheet همان محصول باید مبنای نگهداری قرار گیرد.
برندهای مطرح HEPES
برخی تولیدکنندگان شناخته‌شده عبارت‌اند از:
هنگام مقایسه محصولات باید مشخص شود محصول:
Powder، Solution یا Cell Culture Grade
است.
هنگام خرید HEPES به چه نکاتی توجه کنیم؟
هنگام سفارش بهتر است موارد زیر مشخص شوند:
برای مثال:
HEPES Buffer Solution – 1 M – Sterile – Cell Culture Grade – 100 mL
درخواست بسیار دقیق‌تری نسبت به نوشتن صرفاً «HEPES» است.
چرا Catalog Number برای HEPES مهم است؟
یک تولیدکننده ممکن است HEPES را در انواع مختلف عرضه کند:
بنابراین دو محصول با نام HEPES ممکن است کاربرد متفاوتی داشته باشند.
استفاده از Catalog Number احتمال اشتباه در خرید را کاهش می‌دهد.
وکتور چگونه می‌تواند در تأمین HEPES کمک کند؟
در وکتور می‌توانید درخواست HEPES را با مشخصات دقیق مانند:
ثبت کنید.
سپس پیشنهاد تأمین‌کنندگان را از نظر:
مقایسه کنید.
همچنین اگر HEPES برای Cell Culture موردنیاز باشد، می‌توان مواد مرتبط مانند:
را نیز در کنار آن استعلام کرد.
این موضوع به‌ویژه زمانی اهمیت دارد که آزمایشگاه قصد دارد فرمولاسیون مشخصی از Complete Medium را به‌صورت ثابت تهیه کند.
یکی از خطاهای رایج این است که وقتی رنگ محیط هنگام کار خارج از Incubator سریع تغییر می‌کند، بدون بررسی سایر عوامل مقدار HEPES افزایش داده شود.
قبل از تغییر Buffer بهتر است موارد زیر بررسی شوند:
اگر یک Cell Line برای مدت طولانی با یک فرمولاسیون مشخص کشت شده است، تغییر ناگهانی HEPES می‌تواند یک متغیر جدید وارد آزمایش کند.
در مطالعات مقایسه‌ای بهتر است نوع محیط، مقدار HEPES و شرایط CO₂ بین گروه‌ها ثابت باشند.
همچنین در Live Cell Imagingهای طولانی، کنترل نور و دما به اندازه Buffer اهمیت دارد؛ HEPES نمی‌تواند اثر شرایط نامناسب Imaging را جبران کند.
سؤالات متداول
منابع
- Good NE, Winget GD, Winter W, Connolly TN, Izawa S, Singh RMM. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry
- Freshney RI. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications.
- ATCC. Animal Cell Culture Guide
- Thermo Fisher Scientific / Gibco. HEPES Buffer Solution and Cell Culture Media Technical Documentation
- Merck / Sigma-Aldrich. HEPES Buffer Technical Resources
- Lepe-Zuniga JL, Zigler JS, Gery I. Toxicity of light-exposed HEPES media. Journal of Immunological Methods
- Zigler JS et al. Studies on phototoxicity and hydrogen peroxide generation in HEPES-buffered culture media
- Current Protocols in Cell Biology