MLPA چیست؟
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) یکی از دقیقترین روشهای ژنتیک مولکولی برای بررسی حذف (Deletion) و تکثیر (Duplication) اگزونها یا ژنها است. این تکنیک قادر است بهطور همزمان دهها ناحیه مختلف از ژنوم را در یک واکنش بررسی کند و به همین دلیل در تشخیص بسیاری از بیماریهای ژنتیکی مانند Duchenne Muscular Dystrophy (DMD)، Spinal Muscular Atrophy (SMA)، Charcot-Marie-Tooth (CMT)، Neurofibromatosis، BRCA1/2، Lynch Syndrome و DiGeorge Syndrome کاربرد گستردهای دارد. برخلاف روشهای توالییابی مانند WES و WGS که بیشتر برای شناسایی تغییرات کوچک در توالی DNA (SNV و Indel) استفاده میشوند، MLPA برای تشخیص تغییرات تعداد نسخه (Copy Number Variations یا CNVs) با اندازه کوچک و در سطح یک یا چند اگزون طراحی شده است.
MLPA چیست؟
راهنمای کامل Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification، نحوه عملکرد، مراحل انجام، کاربردها و تفاوت آن با qPCR، FISH، Array CGH و WES
- MLPA روشی برای شناسایی حذف و تکثیر ژنها و اگزونها است.
- این روش برای بررسی Copy Number Variation یا CNV استفاده میشود.
- قادر است دهها ناحیه ژنی را در یک واکنش بررسی کند.
- در تشخیص بیماریهایی مانند DMD، SMA، BRCA1/2 و بسیاری از سندرمهای ژنتیکی کاربرد دارد.
- برای شناسایی جهشهای نقطهای مناسب نیست و معمولاً در کنار روشهای توالییابی استفاده میشود.
MLPA چیست؟
MLPA مخفف Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification است. این روش در سال ۲۰۰۲ توسط Schouten و همکاران معرفی شد و امروزه یکی از روشهای استاندارد برای بررسی تغییرات تعداد نسخه ژن یا CNV در آزمایشگاههای ژنتیک پزشکی محسوب میشود.
در این روش، برای هر ناحیه هدف دو پروب طراحی میشود که در کنار یکدیگر روی DNA هیبرید میشوند. تنها زمانی که هر دو پروب بهدرستی متصل شوند، آنزیم Ligase آنها را به یکدیگر متصل میکند و محصول حاصل در مرحله بعد با PCR تکثیر میشود.
مقدار محصول PCR متناسب با تعداد نسخههای آن ناحیه ژنی است و در نهایت با Capillary Electrophoresis اندازهگیری و با نمونههای کنترل مقایسه میشود.
MLPA چگونه کار میکند؟
اساس MLPA بر اتصال اختصاصی پروبها به ناحیه هدف، اتصال دو نیمه پروب توسط Ligase و سپس تکثیر همزمان تمام پروبهای متصلشده با یک جفت پرایمر مشترک است.
اجزای اصلی آزمایش MLPA
مراحل انجام MLPA
تفسیر نتایج MLPA
در MLPA، نسبت سیگنال هر پروب نسبت به نمونههای کنترل محاسبه میشود. این نسبت نشان میدهد که تعداد نسخه ناحیه هدف طبیعی، کاهشیافته یا افزایشیافته است.
| نسبت تقریبی | تفسیر |
|---|---|
| حدود 0.1 | تعداد نسخه طبیعی |
| حدود 0.5 | حذف هتروزیگوت |
| نزدیک صفر | حذف هموزیگوت |
| حدود 1.5 | Duplication هتروزیگوت |
| بیشتر از 2 | احتمال تکثیرهای پیچیدهتر و نیازمند بررسی بیشتر |
آستانههای دقیق تفسیر بسته به کیت، نرمافزار و اعتبارسنجی داخلی آزمایشگاه ممکن است کمی متفاوت باشد.
کاربردهای MLPA
- Duchenne/Becker Muscular Dystrophy
- Spinal Muscular Atrophy
- BRCA1 و BRCA2
- MSH2 و MLH1
- PMS2 و EPCAM
- Charcot-Marie-Tooth و PMP22
- Neurofibromatosis Type 1
- DiGeorge Syndrome
- Williams Syndrome
- Prader-Willi و Angelman
- بررسی برخی حذفها و تکثیرهای ژنی
- مطالعات تحقیقاتی و تکمیلی
تفاوت MLPA و qPCR
| ویژگی | MLPA | qPCR |
|---|---|---|
| تعداد اهداف | دهها ناحیه در یک واکنش | معمولاً محدود |
| تشخیص CNV | بسیار مناسب | مناسب برای اهداف محدود |
| هزینه برای چندین ژن | اقتصادیتر | با افزایش اهداف بیشتر میشود |
| توان Multiplex | بالا | محدودتر |
تفاوت MLPA و FISH
| ویژگی | MLPA | FISH |
|---|---|---|
| نوع نمونه | DNA استخراجشده | سلول یا بافت |
| وضوح | در سطح اگزون | در سطح کروموزوم |
| مشاهده مستقیم کروموزوم | خیر | بله |
| CNVهای کوچک | بسیار مناسب | محدود |
تفاوت MLPA و Array CGH
| ویژگی | MLPA | Array CGH |
|---|---|---|
| محدوده بررسی | ژنهای هدف | کل ژنوم |
| هزینه | کمتر | بیشتر |
| سرعت | بیشتر | کمتر |
| کشف CNVهای ناشناخته | محدود | بسیار مناسب |
تفاوت MLPA و WES
| ویژگی | MLPA | WES |
|---|---|---|
| هدف اصلی | CNV | SNV و Indel |
| حذف یک اگزون | بسیار مناسب | ممکن است از دست برود یا نیازمند الگوریتم اختصاصی باشد |
| جهش نقطهای | خیر | بله |
| هزینه | کمتر | بیشتر |
مزایا و محدودیتهای MLPA
- حساسیت بالا برای حذف و تکثیر اگزونها
- بررسی همزمان تعداد زیادی از نواحی ژنی
- هزینه کمتر نسبت به بسیاری از روشهای جامعتر
- نیاز به مقدار کم DNA
- مناسب برای آزمایشهای تأییدی
- عدم شناسایی جهشهای نقطهای
- وابستگی به طراحی پروبها
- عدم شناسایی بازآراییهای متعادل
- احتمال نتیجه کاذب در صورت تغییر محل اتصال پروب
- محدود بودن به نواحی موجود در کیت
عوامل مؤثر بر کیفیت نتایج
کاربرد MLPA در آزمایشگاههای مختلف
| نوع آزمایشگاه | کاربرد |
|---|---|
| ژنتیک پزشکی | تشخیص CNVهای بیماریزا |
| نورولوژی | DMD، SMA و CMT |
| سرطان | BRCA و ژنهای مستعدکننده سرطان |
| ژنتیک پیش از تولد | بررسی هدفمند برخی سندرمها |
| تحقیقات | تحلیل تغییرات تعداد نسخه ژن |
وکتور چگونه میتواند در راهاندازی بخش MLPA کمک کند؟
برای انجام MLPA، آزمایشگاهها به مجموعهای از تجهیزات و مواد مصرفی نیاز دارند:
یکی از مهمترین دلایل نتایج غیرقابل تفسیر در MLPA، استفاده از DNA با کیفیت پایین یا تخریبشده است. همچنین وجود یک SNV در محل اتصال پروب میتواند باعث کاهش سیگنال شده و بهاشتباه بهصورت حذف تفسیر شود.
در صورت مشاهده حذف یک اگزون منفرد، بهویژه اگر با فنوتیپ بیمار همخوانی کامل نداشته باشد، توصیه میشود نتیجه با روشی مستقل مانند Sanger Sequencing، qPCR یا روشهای دیگر تأیید شود.
در آزمایشگاههای تشخیصی، تحلیل نتایج MLPA باید با نمونههای کنترل معتبر، نرمافزار اختصاصی و در صورت امکان با تکرار آزمایش در موارد مرزی انجام شود.
برندهای مطرح تجهیزات و کیتهای MLPA
- MRC Holland و SALSA MLPA
- GeneMarker برای تحلیل دادهها
- Coffalyser.Net
- Applied Biosystems 3130
- Applied Biosystems 3500
- SeqStudio Genetic Analyzer
- Thermo Fisher Scientific
- Eppendorf
- Bio-Rad
سؤالات متداول
منابع
- Schouten JP, et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 2002
- MRC Holland. SALSA MLPA General Protocol and Product Documentation
- ACMG. Technical Standards for the Interpretation of Copy Number Variants
- GeneReviews®. Molecular Genetic Testing Approaches
- Thermo Fisher Scientific. Applied Biosystems Genetic Analyzer User Guides
- CLSI. Molecular Diagnostic Methods for Genetic Diseases