MarrowMAX چیست؟

MarrowMAX یک محیط کشت تخصصی و کامل برای سلول‌های خونساز است که به‌طور ویژه در آزمایشگاه‌های سیتوژنتیک برای بررسی نمونه‌های مربوط به بیماری‌های هماتولوژیک کاربرد دارد.

یکی از مهم‌ترین نمونه‌ها در این گروه آسپیره مغز استخوان است.

در بیماری‌هایی مانند لوسمی‌ها، سندرم‌های میلودیسپلاستیک و برخی نئوپلاسم‌های میلوئیدی یا لنفوئیدی، بررسی کروموزومی می‌تواند اطلاعات مهمی درباره وجود ناهنجاری‌های کلونال فراهم کند.

برای انجام کاریوتایپ، باید تعداد کافی سلول در حال تقسیم در اختیار آزمایشگاه قرار گیرد.

MarrowMAX؛ محیط کشت تخصصی مغز استخوان و سلول‌های خونساز

مسیر کلی به‌صورت زیر است:

MarrowMAX برای مرحله کشت این فرایند طراحی شده است.

چرا کشت مغز استخوان با کشت خون معمولی متفاوت است؟

در کاریوتایپ خون محیطی برای بررسی‌های ژنتیک سرشتی، معمولاً لنفوسیت‌های T موجود در خون با یک ماده محرک مانند PHA تحریک می‌شوند تا وارد چرخه تقسیم شوند.

اما در بررسی مغز استخوان یک بیمار مبتلا به بیماری هماتولوژیک، مسئله متفاوت است.

هدف می‌تواند مشاهده سلول‌های متعلق به کلون غیرطبیعی بیماری باشد.

اگر شرایط کشت به شکلی انتخاب شود که جمعیت خاصی از سلول‌های طبیعی بیش از حد تحریک شود، ممکن است نسبت سلول‌های موردنظر تغییر کند.

بنابراین در کشت مغز استخوان، انتخاب:

باید با هدف آزمایش هماهنگ باشد.

MarrowMAX چگونه عمل می‌کند؟

MarrowMAX محیطی است که برای حمایت از رشد کوتاه‌مدت سلول‌های خونساز طراحی شده است.

محیط پایه آن بر اساس RPMI 1640 بهینه‌شده تهیه شده و حاوی ترکیباتی است که نیازهای سلول‌های مغز استخوان و سایر سلول‌های خونساز را تأمین می‌کنند.

یکی از ویژگی‌های مهم MarrowMAX وجود محیط شرطی‌شده حاصل از سلول‌های استرومایی انسانی است.

این بخش از محیط حاوی مجموعه‌ای از عوامل رشد خونساز است که می‌توانند از رشد سلول‌های موردنظر در کشت کوتاه‌مدت حمایت کنند.

هدف نهایی در سیتوژنتیک این است که پس از دوره کشت، تعداد کافی سلول در حال تقسیم برای تهیه متافاز در اختیار آزمایشگاه قرار گیرد.

محیط شرطی‌شده چیست؟

سلول‌هایی که در محیط کشت رشد می‌کنند، مواد مختلفی را به محیط اطراف خود آزاد می‌کنند.

اگر محیطی که سلول‌ها برای مدتی در آن رشد کرده‌اند جمع‌آوری شود، ممکن است حاوی:

باشد.

به چنین محیطی محیط شرطی‌شده گفته می‌شود.

MarrowMAX حاوی محیط شرطی‌شده اختصاصی تولیدشده با استفاده از یک رده سلولی استرومایی مغز استخوان انسانی است.

این ویژگی یکی از تفاوت‌های MarrowMAX با محیط پایه RPMI 1640 محسوب می‌شود.

GCT Conditioned Medium چیست؟

در برخی فرمولاسیون‌های قدیمی‌تر محیط کشت مغز استخوان از محیط شرطی‌شده حاصل از Giant Cell Tumor یا GCT استفاده می‌شد.

هدف از این کار تأمین عوامل رشد موردنیاز سلول‌های خونساز بود.

MarrowMAX از GCT Conditioned Medium استفاده نمی‌کند و به‌جای آن حاوی محیط شرطی‌شده اختصاصی حاصل از سلول‌های استرومایی انسانی است.

سازنده این فرمول را با هدف دستیابی به عملکرد یکنواخت‌تر بین سری‌های تولید و حمایت مناسب از شاخص میتوزی و مورفولوژی کروموزوم‌ها توسعه داده است.

ترکیبات اصلی MarrowMAX

MarrowMAX یک محیط کامل است و از محیط پایه بهینه‌شده به همراه مکمل‌های لازم تشکیل شده است.

از اجزای اصلی اعلام‌شده برای آن می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

این محصول به‌صورت استریل فیلتراسیون شده عرضه می‌شود.

به همین دلیل در استفاده معمول نیازی به افزودن جداگانه سرم، L-Glutamine یا آنتی‌بیوتیک وجود ندارد.

چرا FBS در MarrowMAX وجود دارد؟

FBS یکی از اجزای رایج بسیاری از محیط‌های کشت سلولی است.

سرم می‌تواند مجموعه‌ای از:

را فراهم کند.

اما اضافه کردن FBS به یک محیط پایه در داخل آزمایشگاه می‌تواند یک متغیر دیگر به فرایند کشت اضافه کند.

MarrowMAX از ابتدا به‌صورت محیط کامل و حاوی سرم عرضه می‌شود تا نیاز به مکمل‌سازی جداگانه کاهش پیدا کند.

آیا باید به MarrowMAX سرم اضافه کرد؟

در استفاده معمول خیر.

MarrowMAX یک محیط کامل است و FBS در فرمول آن وجود دارد.

همچنین L-Glutamine و جنتامایسین نیز در محیط وجود دارند.

بنابراین افزودن روتین سرم یا سایر مکمل‌ها بدون وجود یک پروتکل اعتبارسنجی‌شده می‌تواند ترکیب محیط را تغییر دهد.

اگر آزمایشگاه قصد تغییر فرمول محیط را داشته باشد، این تغییر باید بر اساس روش اجرایی مشخص و پس از بررسی عملکرد انجام شود.

MarrowMAX آماده مصرف است؟

بله.

محصول به‌صورت 1X و کامل عرضه می‌شود و پس از ذوب صحیح نیازی به مکمل‌سازی معمول ندارد.

این ویژگی چند مزیت عملی ایجاد می‌کند:

البته آماده مصرف بودن به معنی بی‌اهمیت بودن شرایط نگهداری و آماده‌سازی نیست.

حجم‌ها و شماره کاتالوگ MarrowMAX

MarrowMAX در دو حجم رایج عرضه می‌شود:

هنگام خرید بهتر است شماره کاتالوگ همراه با حجم موردنیاز ثبت شود.

برای آزمایشگاه‌هایی با تعداد نمونه کمتر، حجم بسته‌بندی می‌تواند روی میزان دورریز و هزینه واقعی هر کشت تأثیر قابل توجهی داشته باشد.

MarrowMAX در کشت مغز استخوان

مهم‌ترین کاربرد MarrowMAX در آزمایشگاه سیتوژنتیک، کشت کوتاه‌مدت سلول‌های مغز استخوان است.

نمونه مغز استخوان ممکن است حاوی مجموعه‌ای از سلول‌ها در مراحل مختلف بلوغ باشد.

در بیماری‌های خونی، بخشی از این سلول‌ها ممکن است متعلق به کلون نئوپلاستیک باشند.

هدف کشت این است که تا حد امکان سلول‌های قابل تقسیم حفظ شوند و تعداد مناسبی از آن‌ها در زمان هاروست در مرحله میتوز قرار داشته باشند.

برخلاف کشت آمنیوسیت که تشکیل و رشد کلنی طی چندین روز اهمیت زیادی دارد، کشت مغز استخوان معمولاً کوتاه‌مدت است.

سازنده MarrowMAX نیز کنترل عملکرد محصول را با کشت ۲۴ ساعته سلول‌های مغز استخوان و بررسی شاخص میتوزی و وضوح باندهای کروموزومی انجام می‌دهد.

آیا MarrowMAX فقط برای مغز استخوان است؟

خیر.

با وجود نام Bone Marrow Medium، کاربرد اعلام‌شده محصول محدود به مغز استخوان نیست.

این محیط برای کشت:

در بررسی‌های سیتوژنتیک بیماری‌های هماتولوژیک طراحی شده است.

اما این موضوع به معنی استفاده از MarrowMAX برای هر نوع کاریوتایپ خون نیست.

نوع نمونه و دلیل درخواست آزمایش باید مشخص باشد.

تفاوت خون محیطی در بدخیمی خونی با کاریوتایپ خون معمولی

این تفاوت بسیار مهم است.

در کاریوتایپ سرشتی خون، معمولاً هدف بررسی کروموزوم‌های لنفوسیت‌های فرد است. در نتیجه لنفوسیت‌ها با PHA تحریک می‌شوند.

اما در بیماری‌های هماتولوژیک ممکن است سلول‌های غیرطبیعی بیماری در خون محیطی حضور داشته باشند.

در چنین شرایطی هدف بررسی همان جمعیت خونساز غیرطبیعی است و انتخاب روش کشت باید بر اساس نوع بیماری، تعداد سلول‌های غیرطبیعی و پروتکل آزمایشگاه انجام شود.

بنابراین عبارت «نمونه خون» به‌تنهایی برای انتخاب محیط کشت کافی نیست.

مدت کشت مغز استخوان چقدر است؟

کشت‌های سیتوژنتیک مغز استخوان معمولاً کوتاه‌مدت هستند، اما یک زمان واحد برای تمام نمونه‌ها و تمام بیماری‌ها وجود ندارد.

پروتکل آزمایشگاه ممکن است شامل:

باشد.

به همین دلیل نباید یک زمان ثابت را برای تمام نمونه‌های مغز استخوان به‌عنوان قانون عمومی در نظر گرفت.

انتخاب مدت کشت باید مطابق روش اعتبارسنجی‌شده آزمایشگاه انجام شود.

چرا گاهی چند کشت از یک نمونه مغز استخوان گذاشته می‌شود؟

استفاده از بیش از یک شرایط کشت می‌تواند احتمال دستیابی به جمعیت سلولی موردنظر را افزایش دهد.

برای مثال، ممکن است کشت‌ها از نظر:

با یکدیگر متفاوت باشند.

هدف این است که احتمال از دست دادن کلون غیرطبیعی در اثر یک شرایط کشت نامناسب کاهش پیدا کند.

انتخاب تعداد و نوع کشت‌ها باید بر اساس پروتکل آزمایشگاه و اندیکاسیون بالینی انجام شود.

تراکم سلولی چه اهمیتی دارد؟

تعداد سلول‌ها در حجم مشخصی از محیط می‌تواند روی نتیجه کشت اثر بگذارد.

تراکم بسیار پایین ممکن است باعث کاهش احتمال دستیابی به تعداد کافی سلول در حال تقسیم شود.

در مقابل، تراکم بسیار بالا نیز می‌تواند شرایط محیط را تغییر دهد و عملکرد کشت را تحت تأثیر قرار دهد.

به همین دلیل بهتر است تعداد سلول‌ها و حجم محیط بر اساس پروتکل اعتبارسنجی‌شده آزمایشگاه تنظیم شوند.

در دستورالعمل MarrowMAX نیز نسبت مشخصی برای استفاده از محیط در برابر تعداد سلول‌های تک‌هسته‌ای مغز استخوان ارائه شده است، اما در محیط تشخیصی روش نهایی باید با SOP آزمایشگاه هماهنگ باشد.

نقش Colcemid در کشت MarrowMAX

MarrowMAX محیط رشد سلولی است و وظیفه متوقف کردن سلول‌ها در متافاز را ندارد.

برای افزایش تعداد سلول‌هایی که در زمان هاروست در مرحله متافاز قرار دارند، از موادی مانند Colcemid استفاده می‌شود.

Colcemid با اختلال در تشکیل میکروتوبول‌های دوک تقسیم، مانع ادامه طبیعی میتوز می‌شود و باعث تجمع سلول‌ها در مرحله مناسب برای بررسی کروموزومی می‌شود.

غلظت و زمان تیمار باید بر اساس نوع نمونه و پروتکل آزمایشگاه تنظیم شود.

تیمار بیش از حد می‌تواند روی مورفولوژی کروموزوم‌ها اثر نامطلوب بگذارد.

شرایط نگهداری MarrowMAX

MarrowMAX در حالت منجمد باید در دمای:

و دور از نور نگهداری شود.

محصول با شرایط منجمد حمل می‌شود.

طبق اطلاعات سازنده، عمر محصول در شرایط توصیه‌شده و در بسته‌بندی بازنشده ۱۸ ماه از تاریخ تولید است و نباید پس از تاریخ انقضای درج‌شده استفاده شود.

روش صحیح ذوب MarrowMAX

شرایط ذوب محیط اهمیت زیادی دارد.

طبق دستورالعمل سازنده، MarrowMAX بهتر است به‌صورت کامل و به‌آرامی در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و طی شب ذوب شود.

پس از ذوب، بطری با حرکت آرام مخلوط می‌شود تا محیط یکنواخت شود.

ذوب کردن کامل بطری در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد توصیه نمی‌شود، زیرا می‌تواند باعث ایجاد رسوب شود.

این نکته مهم است، چون گرم کردن سریع محیط کشت لزوماً روش مناسبی برای آماده‌سازی آن نیست.

رسوب یا ذرات در MarrowMAX به چه معناست؟

MarrowMAX حاوی FBS است و ممکن است پس از ذوب یا نگهداری، مواد فلوکولانت یا ذراتی در محیط مشاهده شوند.

وجود چنین موادی الزاماً به معنی خراب بودن محصول نیست.

طبق دستور سازنده، این مواد ممکن است با حرکت آرام و گرم کردن کوتاه‌مدت در حمام آب ۳۷ درجه سانتی‌گراد دوباره در محلول پخش شوند.

اما اگر محیط:

باید قبل از استفاده وضعیت آن بررسی شود.

MarrowMAX پس از ذوب چقدر قابل نگهداری است؟

طبق اطلاعات سازنده، بطری بازنشده پس از ذوب می‌تواند تا ۶۰ روز در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتی‌گراد و دور از نور نگهداری شود؛ مشروط بر اینکه تاریخ انقضای اصلی محصول نیز رعایت شود.

همچنین بهتر است از:

جلوگیری شود.

این ویژگی برای برنامه‌ریزی مصرف در آزمایشگاه اهمیت زیادی دارد.

چرا انجماد و ذوب مکرر مناسب نیست؟

محیط کشت حاوی ترکیبات زیستی متعددی است.

چرخه‌های مکرر انجماد و ذوب می‌توانند روی پایداری برخی اجزای محیط اثر بگذارند.

به همین دلیل بهتر است حجم موردنیاز، دفعات استفاده و برنامه مصرف از قبل در نظر گرفته شود.

در صورت استفاده از روش تقسیم محیط به حجم‌های کوچک‌تر، این کار باید مطابق SOP اعتبارسنجی‌شده آزمایشگاه و با رعایت کامل شرایط استریل انجام شود.

عوامل مؤثر بر کیفیت کشت مغز استخوان

عملکرد کشت فقط به MarrowMAX وابسته نیست.

عوامل مهم عبارت‌اند از:

به همین دلیل، تعداد پایین متافاز را نمی‌توان مستقیماً به محیط کشت نسبت داد.

چرا گاهی مغز استخوان متافاز کمی می‌دهد؟

دلایل متعددی وجود دارند.

ممکن است نمونه:

همچنین شرایط کشت و هاروست نیز می‌توانند مؤثر باشند.

بنابراین هنگام مشاهده متافاز کم باید کل فرایند از نمونه‌گیری تا تهیه لام بررسی شود.

چرا کیفیت کروموزوم‌ها مهم است؟

هدف فقط تولید تعداد زیادی متافاز نیست.

برای انجام G-Banding مناسب، کروموزوم‌ها باید از نظر:

کیفیت مناسبی داشته باشند.

متافازهای بیش از حد متراکم ممکن است وضوح باندی پایینی داشته باشند.

از طرف دیگر، کروموزوم‌های بسیار بلند و ضعیف نیز می‌توانند آنالیز را دشوار کنند.

بنابراین عملکرد کشت باید در کنار کیفیت مراحل هاروست و تهیه لام ارزیابی شود.

کنترل کیفیت MarrowMAX

سازنده هر سری تولید MarrowMAX را از نظر عملکرد بررسی می‌کند.

در کنترل عملکرد، سلول‌های مغز استخوان یک اهداکننده بالغ طبیعی به مدت ۲۴ ساعت در محیط کشت داده شده و مواردی مانند:

ارزیابی می‌شوند.

همچنین محصول پیش از عرضه باید آزمون استریلیتی را پشت سر بگذارد.

برای محیطی که هدف آن سیتوژنتیک است، چنین کنترل عملکردی اهمیت زیادی دارد؛ زیرا صرفاً بررسی pH یا استریلیتی نمی‌تواند نشان دهد محیط تا چه حد قادر به حمایت از سلول‌های در حال تقسیم است.

کنترل عملکرد در آزمایشگاه

آزمایشگاه نیز می‌تواند شاخص‌های عملکرد کشت را در طول زمان پایش کند.

برای مثال:

می‌توانند بررسی شوند.

اگر پس از تغییر Lot محیط، تغییر محسوسی در عملکرد مشاهده شود، بهتر است این موضوع ثبت و در کنار سایر متغیرها بررسی شود.

تفاوت MarrowMAX و RPMI 1640 چیست؟

این دو را نباید صرفاً به‌عنوان دو بطری محیط کشت مقایسه کرد.

RPMI 1640 می‌تواند پایه بسیاری از فرمول‌های کشت باشد، اما MarrowMAX یک فرمول کامل و بهینه‌شده برای کاربرد مشخص است.

تفاوت MarrowMAX و PB-MAX چیست؟

این مقایسه اهمیت زیادی دارد.

MarrowMAX عمدتاً برای کشت کوتاه‌مدت مغز استخوان و سایر سلول‌های خونساز در بررسی بیماری‌های هماتولوژیک طراحی شده است.

PB-MAX محیط تخصصی کاریوتایپ لنفوسیت‌های خون محیطی است و حاوی PHA برای تحریک تقسیم لنفوسیت‌هاست.

به‌صورت ساده:

بنابراین وجود واژه «خون» در کاربرد هر دو محیط نباید باعث شود آن‌ها جایگزین مستقیم یکدیگر در نظر گرفته شوند.

تفاوت MarrowMAX و AmnioMAX چیست؟

این دو محصول متعلق به خانواده محیط‌های تخصصی سیتوژنتیک Gibco هستند، اما برای دو گروه کاملاً متفاوت از نمونه‌ها طراحی شده‌اند.

آیا MarrowMAX برای همه بدخیمی‌های خونی بهترین محیط است؟

نباید یک محیط را بدون توجه به نوع بیماری، نمونه و پروتکل آزمایشگاه برای همه موارد «بهترین» دانست.

رفتار سلولی در:

یکسان نیست.

برخی نمونه‌ها ممکن است به شرایط کشت متفاوت یا پروتکل‌های اختصاصی نیاز داشته باشند.

MarrowMAX یک محیط تخصصی برای سلول‌های خونساز است، اما طراحی پروتکل کشت همچنان بخشی از مسئولیت آزمایشگاه سیتوژنتیک است.

مزایا و محدودیت‌ها

برند و محصول اصلی MarrowMAX

MarrowMAX یک محصول از برند Gibco متعلق به Thermo Fisher Scientific است.

محصول اصلی با نام:

عرضه می‌شود.

دو حجم مهم آن عبارت‌اند از:

در زمان سفارش بهتر است علاوه بر نام محصول، شماره کاتالوگ و حجم نیز درج شوند.

هنگام خرید MarrowMAX به چه نکاتی توجه کنیم؟

هنگام استعلام بهتر است موارد زیر مشخص شوند:

به‌خصوص در مورد محصول وارداتی، فقط تاریخ انقضا کافی نیست و باید از شرایط حمل نیز اطمینان حاصل شود.

حجم ۱۰۰ میلی‌لیتر بهتر است یا ۵۰۰ میلی‌لیتر؟

پاسخ به میزان مصرف آزمایشگاه بستگی دارد.

اگر تعداد نمونه‌های مغز استخوان کم باشد، خرید حجم ۵۰۰ میلی‌لیتر صرفاً به دلیل قیمت پایین‌تر هر میلی‌لیتر ممکن است انتخاب اقتصادی‌تری نباشد.

باید موارد زیر بررسی شوند:

در آزمایشگاه‌های با مصرف بالا، حجم بزرگ‌تر می‌تواند اقتصادی باشد.

در آزمایشگاه‌های کم‌نمونه، کنترل دورریز اهمیت بیشتری پیدا می‌کند.

قیمت واقعی MarrowMAX را چگونه مقایسه کنیم؟

فقط قیمت بطری را مقایسه نکنید.

هزینه واقعی شامل مواردی مانند:

است.

همچنین مقایسه قیمت MarrowMAX کامل با RPMI 1640 خام بدون در نظر گرفتن FBS، مکمل‌ها و آماده‌سازی، مقایسه دقیقی نیست.

سؤالات متداول