PCR چیست؟
PCR یا Polymerase Chain Reaction (واکنش زنجیرهای پلیمراز) یکی از مهمترین تکنیکهای زیستشناسی مولکولی است که برای تکثیر قطعات خاصی از DNA استفاده میشود. این روش که در سال 1983 توسط کری مولیس (Kary Mullis) معرفی شد، امروزه در تشخیص بیماریهای ژنتیکی، شناسایی عوامل عفونی، پزشکی قانونی، تحقیقات زیستی و بسیاری از کاربردهای دیگر استفاده میشود. PCR قادر است از مقدار بسیار کمی DNA، میلیونها تا میلیاردها نسخه تولید کند.
PCR چیست؟
مراحل انجام، کاربردها و تفاوت PCR معمولی با Real-Time PCR
- PCR برای تکثیر انتخابی قطعات مشخص DNA استفاده میشود.
- از سه مرحله اصلی دناتوراسیون، اتصال پرایمر و طویلسازی تشکیل شده است.
- در ژنتیک پزشکی، میکروبیولوژی، انکولوژی و تحقیقات کاربرد دارد.
- پایه بسیاری از روشهای مولکولی مدرن است.
- Real-Time PCR امکان اندازهگیری DNA را در حین واکنش فراهم میکند.
- کیفیت نمونه، طراحی پرایمر و کنترل آلودگی از عوامل اصلی موفقیت هستند.
PCR چیست؟
PCR مخفف Polymerase Chain Reaction یا واکنش زنجیرهای پلیمراز است.
این روش امکان تکثیر انتخابی یک قطعه مشخص از DNA را فراهم میکند. به زبان ساده، اگر تنها چند نسخه از یک قطعه DNA در اختیار داشته باشیم، PCR میتواند آن را به میلیونها نسخه تبدیل کند تا بررسی و تحلیل آن امکانپذیر شود.
PCR یکی از بنیادیترین تکنیکهای زیستشناسی مولکولی است و در بسیاری از آزمایشهای تشخیصی، تحقیقاتی و ژنتیکی به کار میرود.
PCR چگونه کار میکند؟
PCR بر پایه تکرار چرخههای دمایی انجام میشود. هر چرخه شامل سه مرحله اصلی است و با تکرار چرخهها، مقدار DNA هدف بهصورت نمایی افزایش پیدا میکند.
اجزای اصلی واکنش PCR
دستگاه PCR چیست؟
دستگاه PCR یا Thermal Cycler مسئول ایجاد تغییرات دمایی دقیق و تکرارشونده در طول واکنش است.
کاربردهای PCR
- تالاسمی
- SMA
- CF
- DMD
- بسیاری از بیماریهای ارثی
- HPV
- HBV
- HCV
- HIV
- SARS-CoV-2
- EGFR
- KRAS
- BRAF
- ALK
- ROS1
- تعیین هویت
- آزمایش نسبت خانوادگی
- بررسی نمونههای محدود
- مطالعات ژنی
- کلونینگ
- بررسی جهشها
- آمادهسازی برای توالییابی
تفاوت PCR معمولی و Real-Time PCR
| ویژگی | PCR معمولی | Real-Time PCR |
|---|---|---|
| مشاهده محصول | در پایان واکنش | حین واکنش |
| اندازهگیری کمی | معمولاً خیر | بله |
| حساسیت | بالا | بسیار بالا |
| نیاز به ژل | معمولاً بله | معمولاً خیر |
| سرعت تحلیل | کمتر | بیشتر |
| خطر آلودگی پس از PCR | بیشتر | کمتر در سیستم بسته |
| هزینه تجهیزات | کمتر | بیشتر |
مزایا و محدودیتهای PCR
- حساسیت بالا
- اختصاصیت مناسب با طراحی درست
- سرعت مناسب
- نیاز به مقدار کم DNA
- امکان هدفگیری ناحیه مشخص
- حساسیت به آلودگی
- نیاز به طراحی صحیح پرایمر
- احتمال نتایج کاذب در شرایط نامناسب
- نیاز به بررسی محصول در PCR معمولی
- محدودیت در بررسی ناهنجاریهای ناشناخته
عوامل مؤثر بر کیفیت PCR
کاربرد PCR در آزمایشگاههای مختلف
| نوع آزمایشگاه | کاربرد |
|---|---|
| ژنتیک پزشکی | بررسی بیماریهای ارثی |
| مولکولی | مطالعات ژنی و تکثیر هدفمند |
| ویروسشناسی | تشخیص عفونتها |
| انکولوژی | بررسی جهشها و مارکرهای مولکولی |
| تحقیقاتی | مطالعات زیستی و کلونینگ |
| پزشکی قانونی | تعیین هویت و نسبت خانوادگی |
تجهیزات و مواد موردنیاز برای PCR
- Thermal Cycler
- Gradient در برخی مدلها
- Heated Lid
- Taq Polymerase
- dNTP
- Buffer
- MgCl₂
- Forward Primer
- Reverse Primer
- طراحی اختصاصی
- PCR Tube
- PCR Plate
- Cap Strip
- سمپلر
- Filter Tip
- میکروسانتریفیوژ
- کیت استخراج
- میکروتیوب
- مواد کنترل کیفیت
وکتور چگونه میتواند در راهاندازی PCR کمک کند؟
راهاندازی PCR فقط به خرید دستگاه محدود نمیشود و معمولاً مجموعهای از تجهیزات و مواد مصرفی باید هماهنگ با یکدیگر تهیه شوند.
در بسیاری از آزمایشگاههای ژنتیک، کیفیت DNA استخراجشده و طراحی صحیح پرایمر مهمترین عوامل موفقیت PCR هستند.
استفاده از سرسمپلرهای فیلتردار، جداسازی فضاهای Pre-PCR و Post-PCR و استفاده از کنترل منفی میتواند احتمال آلودگی را بهطور قابلتوجهی کاهش دهد.
در PCR معمولی، بررسی اندازه باند روی ژل و توجه به باندهای غیراختصاصی برای تفسیر درست نتیجه اهمیت دارد.
برندهای مطرح تجهیزات و مواد PCR
- Applied Biosystems
- Bio-Rad
- Eppendorf
- Thermo Scientific
- Axygen
- Nest
- SPL
- Sarstedt
- Thermo Fisher Scientific
- QIAGEN
- Promega
- Takara
- Bio-Rad
سؤالات متداول
منابع
- Mullis K. The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction
- Molecular Cloning: A Laboratory Manual
- PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications
- MIQE Guidelines for qPCR Experiments
- Current Protocols in Molecular Biology
- Principles and Technical Aspects of PCR Amplification