فیتوهماگلوتینین چیست؟
فیتوهماگلوتینین یا Phytohemagglutinin (PHA) یک لکتین گیاهی و یکی از مهمترین میتوژنهای مورد استفاده در آزمایشگاههای سیتوژنتیک است. PHA بهویژه برای تحریک لنفوسیتهای T موجود در خون محیطی و سوق دادن آنها از حالت استراحت به سمت فعالشدن و تقسیم سلولی استفاده میشود. از آنجا که برای تهیه کاریوتایپ به سلولهای در حال تقسیم و متافازهای مناسب نیاز داریم، PHA یکی از مواد کلیدی در کشت خون محیطی برای بررسی کروموزومها محسوب میشود. کیفیت PHA، شرایط کشت، زمان انکوباسیون و وضعیت نمونه همگی میتوانند بر تعداد و کیفیت متافازهای حاصل تأثیر بگذارند.
فیتوهماگلوتینین (PHA) چیست؟
کاربرد، مکانیسم اثر و نقش آن در کشت لنفوسیت و کاریوتایپ
- PHA یک لکتین گیاهی با خاصیت Mitogenic است که برای تحریک تقسیم لنفوسیتها استفاده میشود.
- مهمترین کاربرد آن در سیتوژنتیک، کشت لنفوسیتهای خون محیطی برای انجام کاریوتایپ است.
- PHA عمدتاً موجب فعالشدن و تکثیر لنفوسیتهای T میشود.
- PHA-M و PHA-P از انواع شناختهشده محصولات PHA هستند و از نظر فرمولاسیون با یکدیگر تفاوت دارند.
- کیفیت نمونه، نوع PHA، شرایط نگهداری و وضعیت کشت میتوانند بر Mitotic Index و کیفیت متافازها تأثیر بگذارند.
فیتوهماگلوتینین (PHA) چیست؟
فیتوهماگلوتینین یک Lectin گیاهی است که بهطور کلاسیک از لوبیای قرمز یا Phaseolus vulgaris استخراج میشود.
لکتینها پروتئینهایی هستند که توانایی اتصال اختصاصی به ساختارهای کربوهیدراتی موجود روی سطح سلولها را دارند.
PHA به دلیل توانایی تحریک تکثیر لنفوسیتها اهمیت ویژهای در آزمایشگاه پیدا کرده است.
در خون محیطی انسان، بیشتر لنفوسیتها در شرایط معمول در حالت G0 یا Resting State قرار دارند و فعالانه تقسیم نمیشوند.
این موضوع برای کاریوتایپ مشکل ایجاد میکند، زیرا برای مشاهده کروموزومها به سلولهایی نیاز داریم که وارد میتوز شده باشند.
PHA با تحریک لنفوسیتها باعث فعالشدن آنها و ورودشان به چرخه سلولی میشود و در نتیجه امکان دستیابی به سلولهای میتوتیک و متافازهای مناسب فراهم میشود.
PHA چگونه عمل میکند؟
PHA با اتصال به گلیکوپروتئینها و ساختارهای سطح سلول میتواند مسیرهای سیگنالینگ مرتبط با فعالشدن لنفوسیتها را تحریک کند.
در نتیجه، لنفوسیتهای T که در ابتدا در حالت استراحت قرار دارند، فعال شده و وارد چرخه سلولی میشوند.
بهطور ساده میتوان این فرآیند را به شکل زیر در نظر گرفت:
پس از ورود سلولها به چرخه تقسیم، در زمان مناسب میتوان با استفاده از موادی مانند Colcemid تعداد بیشتری از سلولهای میتوتیک مناسب برای بررسی کروموزومی را جمعآوری کرد.
چرا در کاریوتایپ خون محیطی به PHA نیاز داریم؟
خون محیطی یکی از رایجترین نمونهها برای انجام کاریوتایپ Constitutional است.
اما یک مسئله وجود دارد:
گلبولهای قرمز هسته ندارند و برای کاریوتایپ قابل استفاده نیستند. بسیاری از لنفوسیتهای موجود در خون نیز در زمان نمونهگیری فعالانه تقسیم نمیشوند.
بنابراین برای تهیه متافاز باید جمعیتی از لنفوسیتها را وارد چرخه سلولی کنیم.
PHA این وظیفه را بر عهده دارد.
به همین دلیل، اضافه کردن یک Mitogen مناسب یکی از مراحل مهم کشت لنفوسیت خون محیطی است.
نقش PHA در کشت خون محیطی
در کشت روتین خون محیطی برای کاریوتایپ، نمونه خون در محیط کشت مناسب قرار میگیرد و مواد لازم برای رشد سلولی به آن اضافه میشوند.
بسته به پروتکل آزمایشگاه، محیط کشت ممکن است شامل ترکیباتی مانند:
PHA لنفوسیتها را تحریک میکند تا وارد چرخه تقسیم شوند.
پس از طی مدت مناسب کشت، معمولاً مراحل بعدی شامل:
خواهد بود.
جزئیات هر مرحله باید بر اساس پروتکل معتبرشده آزمایشگاه تعیین شود.
PHA بیشتر کدام سلولها را تحریک میکند؟
PHA بهعنوان یک T-cell Mitogen شناخته میشود و عمدتاً باعث تحریک و تکثیر T lymphocytes میشود.
این ویژگی باعث شده است که PHA برای کشت خون محیطی در سیتوژنتیک بسیار مناسب باشد.
در مقابل، برای تحریک برخی جمعیتهای دیگر لنفوسیتی میتوان از Mitogenهای متفاوتی استفاده کرد.
بنابراین انتخاب Mitogen به نوع سلول و هدف آزمایش بستگی دارد.
انواع PHA
محصولات PHA در شکلها و فرمولاسیونهای مختلف عرضه میشوند. دو نامی که معمولاً دیده میشوند عبارتاند از:
PHA-M و PHA-P را نباید صرفاً بر اساس نام بهصورت مستقیم جایگزین یکدیگر کرد. غلظت، Activity، فرمولاسیون و دستورالعمل شرکت سازنده باید بررسی شوند.
تفاوت PHA-M و PHA-P
| ویژگی | PHA-M | PHA-P |
|---|---|---|
| نوع محصول | فرم تجاری PHA | فرم تجاری PHA |
| کاربرد کشت لنفوسیت | رایج | قابل استفاده بسته به محصول |
| شکل عرضه | وابسته به سازنده | وابسته به سازنده |
| آمادهسازی | طبق دستور سازنده | طبق دستور سازنده |
| انتخاب | بر اساس پروتکل | بر اساس پروتکل |
هنگام تغییر برند یا نوع PHA بهتر است مشخصات محصول جدید بررسی و در صورت نیاز عملکرد آن در شرایط آزمایشگاه ارزیابی شود.
کاربردهای PHA
آیا در تمام نمونههای کاریوتایپ از PHA استفاده میشود؟
خیر.
PHA عمدتاً در کشت لنفوسیتهای خون محیطی اهمیت دارد.
نمونههایی مانند Bone Marrow ممکن است حاوی جمعیتهایی از سلولهای در حال تقسیم باشند و روش کشت آنها با خون محیطی متفاوت باشد.
همچنین در Amniotic Fluid و Chorionic Villus Sample نیز نوع سلول و روش کشت متفاوت است و PHA همان نقش کلاسیک کشت خون محیطی را ندارد.
بنابراین نباید پروتکل Peripheral Blood Cytogenetics را مستقیماً به سایر نمونهها تعمیم داد.
عوامل مؤثر بر عملکرد PHA
عملکرد PHA و میزان تکثیر لنفوسیتها میتواند تحت تأثیر عوامل متعددی قرار گیرد:
به همین دلیل کاهش تعداد متافازها همیشه به معنای مشکل PHA نیست.
ارتباط PHA و Mitotic Index
Mitotic Index به نسبت سلولهای در حال میتوز در یک جمعیت سلولی اشاره دارد.
در کشت لنفوسیت خون محیطی، تحریک مناسب سلولها توسط PHA میتواند باعث افزایش تعداد سلولهایی شود که وارد چرخه سلولی و در نهایت میتوز میشوند.
اگر تحریک سلولی ضعیف باشد، ممکن است هنگام Harvest تعداد متافازهای قابل بررسی کم باشد.
با این حال Mitotic Index تحت تأثیر عوامل متعددی است و تنها با تغییر مقدار PHA نمیتوان تمام مشکلات کشت را برطرف کرد.
ارتباط PHA و Colcemid چیست؟
PHA و Colcemid هر دو در کاریوتایپ خون محیطی استفاده میشوند، اما وظیفه کاملاً متفاوتی دارند.
| ماده | نقش |
|---|---|
| PHA | تحریک لنفوسیت برای ورود به چرخه سلولی |
| Colcemid | اختلال در دوک میتوزی و افزایش تجمع سلولهای میتوتیک مناسب |
| KCl | ایجاد شرایط Hypotonic |
| Methanol/Acetic Acid | Fixation |
| Trypsin | تیمار کروموزوم در GTG Banding |
| Giemsa | ایجاد/نمایش الگوی باند پس از تیمار مناسب |
بنابراین PHA در مراحل ابتدایی کشت نقش دارد، در حالی که Colcemid نزدیک به مرحله Harvest استفاده میشود.
مزایا و محدودیتها
- تحریک مؤثر لنفوسیتهای T
- کاربرد گسترده در کاریوتایپ خون محیطی
- کمک به افزایش سلولهای واردشده به چرخه تقسیم
- سابقه طولانی استفاده در سیتوژنتیک و تحقیقات ایمنیشناسی
- دسترسی به محصولات تجاری استاندارد
- قابلیت استفاده در مطالعات Lymphocyte Proliferation
- برای تمام انواع سلولها و نمونههای سیتوژنتیک مناسب نیست.
- پاسخ سلولی به PHA میتواند بین نمونهها متفاوت باشد.
- عملکرد آن به کیفیت و شرایط نگهداری محصول وابسته است.
- شرایط نامناسب کشت میتواند حتی در حضور PHA مناسب باعث کاهش Mitotic Index شود.
- انواع و فرمولاسیونهای مختلف PHA الزاماً بهصورت مستقیم قابل جایگزینی نیستند.
- کیفیت پایین نمونه میتواند پاسخ لنفوسیتی را کاهش دهد.
چرا ممکن است کشت PHA متافاز کمی داشته باشد؟
اگر یک کشت خون محیطی تعداد متافاز کمی داشته باشد، چندین عامل باید بررسی شوند.
از جمله:
بنابراین بهتر است کل فرآیند بررسی شود و مشکل مستقیماً به PHA نسبت داده نشود.
نگهداری PHA
شرایط نگهداری PHA بسته به محصول و فرمولاسیون آن متفاوت است.
بنابراین اطلاعات شرکت سازنده باید مرجع اصلی باشد.
بهطور کلی باید به موارد زیر توجه شود:
در صورت تقسیم محصول به Aliquot نیز باید شرایط توصیهشده سازنده رعایت شود.
برندهای مطرح PHA
تولیدکنندگان مختلفی محصولات Phytohemagglutinin و مواد مورد استفاده در Cytogenetics را عرضه میکنند، از جمله:
هنگام مقایسه محصولات بهتر است نوع PHA، Activity، فرمولاسیون، حجم، شرایط نگهداری و شماره کاتالوگ بررسی شوند.
هنگام انتخاب PHA به چه نکاتی توجه کنیم؟
هنگام تهیه Phytohemagglutinin بهتر است موارد زیر بررسی شوند:
اگر آزمایشگاه قصد تغییر برند PHA را دارد، بهتر است محصول جدید مستقیماً و بدون ارزیابی جایگزین محصول قبلی نشود؛ زیرا Activity و فرمولاسیون محصولات میتوانند متفاوت باشند.
وکتور چگونه میتواند در تأمین PHA کمک کند؟
PHA یکی از مواد تخصصی مورد استفاده در آزمایشگاههای سیتوژنتیک است و ممکن است با برندها، فرمولاسیونها و حجمهای مختلف عرضه شود.
در وکتور میتوانید درخواست خرید PHA را با مشخص کردن:
همچنین امکان استعلام سایر مواد مورد نیاز کشت کروموزومی مانند:
وجود دارد و میتوان مجموعه مواد موردنیاز کاریوتایپ را بهصورت همزمان بررسی کرد.
در کشت روتین خون محیطی، اگر تعداد متافازها بهطور غیرمنتظره کاهش پیدا کند، یکی از اولین مواردی که ممکن است مورد توجه قرار گیرد PHA است؛ اما در عمل ضعف رشد سلولی میتواند دلایل متعددی داشته باشد.
برای مثال، نمونهای که با تأخیر زیاد به آزمایشگاه رسیده یا در شرایط نامناسب حمل شده است ممکن است حتی با PHA مناسب نیز پاسخ مطلوبی نداشته باشد.
از طرف دیگر، اگر پس از تغییر Lot یا برند PHA کاهش مداوم Mitotic Index در تعداد زیادی از کشتها مشاهده شود، بررسی عملکرد Lot جدید منطقی است.
به همین دلیل ثبت Lot Number مواد کشت و کنترل تغییرات عملکرد کشت در طول زمان میتواند برای شناسایی مشکلات احتمالی بسیار مفید باشد.
سؤالات متداول
منابع
- Moorhead PS, et al. Chromosome Preparations of Leukocytes Cultured from Human Peripheral Blood. Experimental Cell Research
- Hungerford DA. Leukocytes Cultured from Small Inocula of Whole Blood and the Preparation of Metaphase Chromosomes by Treatment with Hypotonic KCl. Stain Technology
- Arsham MS, Barch MJ, Lawce HJ. The AGT Cytogenetics Laboratory Manual
- Rooney DE. Human Cytogenetics: Constitutional Analysis – A Practical Approach
- Thermo Fisher Scientific / Gibco. Phytohemagglutinin Technical Documentation
- Merck / Sigma-Aldrich. Phytohemagglutinin Product Documentation
- Current Protocols in Human Genetics
- Freshney RI. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications