Real-Time PCR چیست؟
Real-Time PCR یا qPCR یکی از پرکاربردترین روش‌های زیست‌شناسی مولکولی برای تکثیر و اندازه‌گیری هم‌زمان DNA است. برخلاف PCR معمولی که نتیجه در پایان واکنش مشاهده می‌شود، در Real-Time PCR میزان DNA در هر چرخه به‌صورت لحظه‌ای اندازه‌گیری می‌شود. این فناوری امروزه در تشخیص بیماری‌های عفونی، ژنتیکی، سرطان، بررسی بیان ژن و تحقیقات زیستی کاربرد گسترده دارد.
Real-Time PCR چیست؟
کاربردها، مزایا و تفاوت آن با PCR معمولی
- DNA را تکثیر و هم‌زمان میزان فلورسانس را اندازه‌گیری می‌کند.
- در مقایسه با PCR معمولی امکان تحلیل کمی و پایش واکنش در هر چرخه را فراهم می‌کند.
- برای مشاهده نتیجه معمولاً به ژل الکتروفورز نیاز ندارد.
- در HPV، بیماری‌های عفونی، سرطان، ژنتیک پزشکی و بیان ژن کاربرد دارد.
- از رنگ‌های فلورسنت مانند SYBR Green یا پروب‌های اختصاصی مانند TaqMan استفاده می‌کند.
- کیفیت نمونه، طراحی پرایمر و کنترل آلودگی از عوامل اصلی موفقیت هستند.
Real-Time PCR چیست؟
Real-Time PCR که با نام qPCR نیز شناخته می‌شود، روشی برای تکثیر DNA و پایش هم‌زمان میزان محصول در طول واکنش است.
دستگاه در هر چرخه میزان فلورسانس را ثبت می‌کند و بر اساس تغییر سیگنال، مقدار نسبی یا مطلق DNA موجود در نمونه را برآورد می‌کند.
در صورت شروع از RNA، ابتدا RNA به cDNA تبدیل می‌شود و سپس واکنش Real-Time PCR انجام می‌گیرد؛ این فرایند معمولاً RT-qPCR نامیده می‌شود.
Real-Time PCR چگونه کار می‌کند؟
فلورسانس در Real-Time PCR
- به DNA دو رشته‌ای متصل می‌شود.
- هزینه کمتر
- طراحی ساده‌تر
- نیازمند بررسی Melt Curve
- اختصاصیت کمتر نسبت به پروب اختصاصی
- پروب اختصاصی دارای Fluorophore و Quencher
- اختصاصیت بالاتر
- مناسب Multiplex
- هزینه طراحی و اجرا بیشتر
- احتمال کمتر سیگنال غیراختصاصی
Ct چیست؟
Ct یا Cycle Threshold چرخه‌ای است که در آن سیگنال فلورسانس از آستانه تعیین‌شده عبور می‌کند.
مقدار Ct نباید بدون توجه به نوع کیت، منحنی تکثیر، کنترل‌ها و معیارهای اعتبارسنجی تفسیر شود.
تفاوت PCR معمولی و Real-Time PCR
| ویژگی | PCR معمولی | Real-Time PCR |
|---|---|---|
| مشاهده نتیجه | در پایان واکنش | حین واکنش |
| اندازه‌گیری کمی | معمولاً خیر | بله |
| نیاز به ژل | معمولاً بله | معمولاً خیر |
| حساسیت | بالا | بسیار بالا |
| اختصاصیت | وابسته به طراحی پرایمر | با پروب اختصاصی بالاتر |
| سرعت تحلیل | کمتر | بیشتر |
| خطر آلودگی پس از PCR | بیشتر به دلیل بازکردن تیوب | کمتر در سیستم بسته |
کاربردهای Real-Time PCR
- HPV
- HBV
- HCV
- HIV
- SARS-CoV-2
- بررسی جهش‌های مشخص
- مطالعات ژنی
- برخی تست‌های قبل از تولد
- Copy Number Analysis
- EGFR
- BCR-ABL
- HER2
- KRAS
- بررسی Minimal Residual Disease
- Gene Expression
- RT-qPCR
- مطالعات تحقیقاتی
- بررسی ژن‌های مرجع
Melt Curve چیست؟
در واکنش‌های مبتنی بر SYBR Green، منحنی ذوب برای بررسی اختصاصیت محصول استفاده می‌شود. با افزایش تدریجی دما، DNA دو رشته‌ای ذوب می‌شود و کاهش فلورسانس ثبت می‌گردد.
- یک پیک واضح
- دمای ذوب سازگار با محصول هدف
- عدم وجود پیک‌های اضافه
- چند پیک
- Primer-Dimer
- محصول غیراختصاصی
- تکرارپذیری ضعیف
مزایا و محدودیت‌های Real-Time PCR
- حساسیت بسیار بالا
- اختصاصیت بالا با پروب مناسب
- سرعت مناسب
- عدم نیاز به ژل الکتروفورز
- امکان اندازه‌گیری کمی
- کاهش آلودگی پس از PCR
- هزینه بالاتر دستگاه و مواد
- نیاز به طراحی صحیح پرایمر و پروب
- حساسیت بالا به آلودگی
- نیاز به کنترل‌های دقیق
- تفسیر وابسته به کیفیت منحنی‌ها
عوامل مؤثر بر کیفیت نتیجه
کاربرد در آزمایشگاه‌های مختلف
| نوع آزمایشگاه | کاربرد |
|---|---|
| ژنتیک پزشکی | بررسی بیماری‌های ارثی و تغییرات ژنی |
| مولکولی | مطالعات ژنی و کمی‌سازی DNA/RNA |
| ویروس‌شناسی | تشخیص و پایش عفونت‌ها |
| انکولوژی | بررسی جهش‌ها و مارکرهای مولکولی |
| تحقیقاتی | Gene Expression و Validation |
| میکروبیولوژی | شناسایی عوامل میکروبی |
تجهیزات و مواد موردنیاز
- تعداد کانال فلورسانس
- ظرفیت ۴۸ یا ۹۶ خانه
- نرم‌افزار تحلیل
- DNA
- RNA
- کیفیت و خلوص مناسب
- SYBR Green
- Probe-based
- One-Step RT-qPCR
- طراحی اختصاصی
- کنترل کیفیت
- Multiplex Compatibility
- PCR Plate
- Optical Film
- Cap Strip
- سمپلر
- Filter Tip
- میکروسانتریفیوژ
وکتور چگونه می‌تواند در راه‌اندازی Real-Time PCR کمک کند؟
راه‌اندازی Real-Time PCR فقط به خرید دستگاه محدود نمی‌شود و باید مواد مصرفی، کیت استخراج، مسترمیکس، پرایمر و پروب و تجهیزات جانبی نیز به‌صورت هماهنگ انتخاب شوند.
در بسیاری از آزمایشگاه‌های ژنتیک، کیفیت استخراج DNA یا RNA یکی از مهم‌ترین عوامل موفقیت Real-Time PCR است.
بررسی Amplification Curve و Melt Curve در کنار مقدار Ct می‌تواند به شناسایی نتایج غیرواقعی، Primer-Dimer یا آلودگی احتمالی کمک کند.
همچنین جداسازی فضاهای Pre-PCR و Post-PCR و استفاده از Filter Tip نقش مهمی در کنترل آلودگی دارند.
برندهای مطرح Real-Time PCR
- Applied Biosystems StepOne
- Applied Biosystems QuantStudio
- Bio-Rad CFX96
- Roche LightCycler
- Qiagen Rotor-Gene
- Agilent
- Bioneer
- تعداد کانال فلورسانس
- ظرفیت نمونه
- سرعت Run
- Multiplex Capability
- نرم‌افزار تحلیل
- کالیبراسیون و خدمات
- سازگاری با پلیت و تیوب
سؤالات متداول
منابع
- MIQE Guidelines for qPCR Experiments
- Real-Time PCR, Dorak
- Applied Biosystems Real-Time PCR Handbook
- Bio-Rad qPCR Applications Guide
- Current Protocols in Molecular Biology
- Principles and Technical Aspects of PCR Amplification