تریپسین چیست؟
تریپسین (Trypsin) یک آنزیم پروتئولیتیک از خانواده سرین پروتئازها (Serine Proteases) است که توانایی شکستن برخی پیوندهای پپتیدی پروتئینها را دارد. یکی از مهمترین کاربردهای آزمایشگاهی تریپسین، جدا کردن سلولهای چسبنده از سطح فلاسک یا پلیت در کشت سلولی است. این ماده اغلب بهصورت Trypsin-EDTA عرضه میشود و در فرآیند پاساژ سلولی، شمارش سلول، فریز سلولی و آمادهسازی نمونه برای آزمایشهای بعدی کاربرد دارد. غلظت تریپسین، مدت تماس با سلول و نوع رده سلولی از عوامل مهم در عملکرد صحیح آن هستند.
تریپسین (Trypsin) چیست؟
کاربردها، نحوه عملکرد و نقش آن در کشت سلول
- تریپسین یک آنزیم پروتئولیتیک است که برای تجزیه پروتئینها استفاده میشود.
- در کشت سلول، مهمترین کاربرد آن جدا کردن سلولهای چسبنده از سطح فلاسک یا پلیت است.
- محلول Trypsin-EDTA یکی از رایجترین مواد مورد استفاده برای پاساژ سلولهای چسبنده است.
- غلظت تریپسین و مدت زمان تماس باید بر اساس نوع سلول و پروتکل مورد استفاده انتخاب شود.
- تماس بیش از حد سلولها با تریپسین میتواند به پروتئینهای سطحی آسیب رسانده و روی Viability و رفتار سلول تأثیر بگذارد.
تریپسین چیست؟
تریپسین یک آنزیم پروتئولیتیک است که در شرایط طبیعی نقش مهمی در هضم پروتئینها دارد. پیشساز غیرفعال این آنزیم یعنی Trypsinogen در پانکراس تولید شده و پس از فعال شدن به Trypsin تبدیل میشود.
در محیط آزمایشگاهی از خاصیت پروتئولیتیک تریپسین در حوزههای مختلف استفاده میشود. یکی از شناختهشدهترین کاربردهای آن در کشت سلولهای چسبنده (Adherent Cell Culture) است.
سلولهای Adherent برای رشد به سطح ظروف کشت متصل میشوند. هنگامی که سلولها به تراکم موردنظر میرسند و نیاز به پاساژ دارند، باید از سطح فلاسک یا پلیت جدا شوند.
تریپسین با اثر روی برخی پروتئینهای دخیل در چسبندگی سلول، جدا شدن سلولها را تسهیل میکند.
تریپسین چگونه عمل میکند؟
تریپسین عمدتاً پیوندهای پپتیدی را در سمت کربوکسیلی اسیدهای آمینه Lysine و Arginine هیدرولیز میکند.
در کشت سلولی، فعالیت پروتئولیتیک تریپسین روی پروتئینهای مرتبط با چسبندگی باعث کاهش اتصال سلولها به یکدیگر و سطح ظرف میشود.
پس از مدت زمان مناسب، سلولها شروع به جدا شدن از سطح میکنند و میتوان آنها را برای انتقال به فلاسک جدید، شمارش، فریز یا سایر آزمایشها جمعآوری کرد.
Trypsinization چیست؟
Trypsinization به فرآیند استفاده از تریپسین برای جدا کردن سلولهای چسبنده از سطح ظروف کشت گفته میشود. این فرآیند یکی از مراحل رایج در Passage یا Subculture سلولهای Adherent است.
زمان و شرایط دقیق این فرآیند برای همه ردههای سلولی یکسان نیست و باید پروتکل مربوط به همان سلول و دستورالعمل محصول مورد استفاده رعایت شود.
Trypsin-EDTA چیست؟
Trypsin-EDTA یکی از متداولترین فرمولاسیونهای مورد استفاده در کشت سلول است.
EDTA یا Ethylenediaminetetraacetic Acid یک عامل Chelating است که میتواند یونهای دوظرفیتی مانند کلسیم و منیزیم را متصل کند.
کلسیم و منیزیم در عملکرد تعدادی از مولکولهای چسبندگی سلولی نقش دارند. کاهش دسترسی به این یونها میتواند اتصال سلولها را ضعیفتر کرده و عملکرد تریپسین را در جدا کردن سلول تسهیل کند.
به همین دلیل در بسیاری از پروتکلهای کشت سلول از ترکیب Trypsin + EDTA استفاده میشود.
انواع محلول تریپسین
- حاوی آنزیم تریپسین است.
- برای کاربردهایی مناسب است که وجود EDTA موردنظر نیست.
- یکی از رایجترین فرمولاسیونها
- مناسب جداسازی بسیاری از سلولهای چسبنده
- در برخی محصولات Phenol Red بهعنوان شاخص pH وجود دارد.
- برای کاربردهایی که حضور Phenol Red میتواند با آزمایشهای بعدی تداخل داشته باشد.
غلظت تریپسین
محلولهای تجاری Trypsin-EDTA ممکن است با غلظتها و فرمولاسیونهای مختلف عرضه شوند و انتخاب آنها باید بر اساس نیاز واقعی آزمایشگاه انجام شود.
بنابراین نمیتوان یک غلظت را بهعنوان بهترین گزینه برای تمام ردههای سلولی معرفی کرد.
کاربردهای تریپسین در آزمایشگاه
- Passage سلولی
- Subculture
- جمعآوری سلول
- شمارش سلول
- آمادهسازی برای Cryopreservation
- Flow Cytometry در پروتکلهای مناسب
- آزمایشهای مولکولی
- هضم پروتئین
- تبدیل پروتئینها به Peptide
- آمادهسازی برای Mass Spectrometry
- GTG Banding
- تیمار کنترلشده کروموزومهای متافازی
- رنگآمیزی با Giemsa
کاربرد تریپسین در پروتئومیکس
تریپسین یکی از مهمترین آنزیمها در Proteomics است. در بسیاری از روشهای Mass Spectrometry، پروتئینها پیش از آنالیز به قطعات کوچکتر یا Peptide تبدیل میشوند.
تریپسین به دلیل ویژگی برش نسبتاً مشخص خود یکی از پرکاربردترین آنزیمها برای هضم پروتئین در این حوزه محسوب میشود.
کاربرد تریپسین در G-Banding
تریپسین در سیتوژنتیک نیز کاربرد مهمی دارد. در روش GTG Banding یا G-Banding، کروموزومهای متافازی بهصورت کنترلشده با تریپسین تیمار شده و سپس با Giemsa رنگآمیزی میشوند.
این فرآیند باعث ایجاد الگوی مشخص باندهای روشن و تیره روی کروموزومها میشود.
شرایط استفاده از تریپسین در G-Banding با Trypsinization در کشت سلولی متفاوت است.
عوامل مؤثر بر عملکرد تریپسین
چرا زمان تماس با تریپسین مهم است؟
یکی از مهمترین مسائل در استفاده از تریپسین، جلوگیری از Over-Trypsinization است. تریپسین تنها پروتئینهای اتصالدهنده سلول به ظرف را تحت تأثیر قرار نمیدهد. تماس طولانی میتواند برخی پروتئینهای سطحی سلول را نیز تخریب کند.
در بسیاری از پروتکلها وضعیت سلولها هنگام Trypsinization پایش میشود تا پس از جدا شدن مناسب، فعالیت آنزیم متوقف شود.
مزایا و محدودیتهای تریپسین
- جداسازی سریع سلولهای چسبنده
- استفاده آسان در کشت سلولی
- دسترسی گسترده به محصولات تجاری آماده
- قابلیت استفاده برای بسیاری از ردههای سلولی
- امکان ترکیب با EDTA برای تسهیل جداسازی سلول
- کاربرد گسترده در کشت سلول، سیتوژنتیک و پروتئومیکس
- تماس بیش از حد میتواند به پروتئینهای سطح سلول آسیب برساند.
- همه ردههای سلولی حساسیت یکسانی به تریپسین ندارند.
- استفاده نامناسب ممکن است Viability سلول را کاهش دهد.
- فعالیت آنزیم به شرایط محیطی و نگهداری وابسته است.
- برای برخی سلولهای حساس، روشهای ملایمتر جداسازی مناسبتر هستند.
- شرایط Trypsinization باید برای هر نوع سلول بهینه یا طبق پروتکل معتبر انتخاب شود.
مقایسه تریپسین با سایر مواد جداکننده سلول
| ماده | ویژگی کلی | کاربرد |
|---|---|---|
| Trypsin | آنزیم پروتئولیتیک | جداسازی سلولهای Adherent |
| Trypsin-EDTA | تریپسین همراه EDTA | پاساژ بسیاری از سلولهای چسبنده |
| Accutase | روش آنزیمی ملایمتر در برخی کاربردها | سلولهای حساس و برخی کاربردهای تخصصی |
| TrypLE | آنزیم Recombinant | جایگزین Trypsin در برخی پروتکلها |
| EDTA | روش غیرپروتئولیتیک | جداسازی برخی سلولها |
انتخاب بین این مواد باید بر اساس نوع سلول و کاربرد بعدی انجام شود.
نگهداری تریپسین
شرایط نگهداری تریپسین به فرمولاسیون و شرکت سازنده بستگی دارد و باید اطلاعات درجشده روی محصول یا Datasheet بررسی شود.
برای مواد کشت سلولی، رعایت Cold Chain و دستورالعمل سازنده میتواند نقش مهمی در حفظ کیفیت محصول داشته باشد.
برندهای مطرح تریپسین
- Gibco / Thermo Fisher Scientific
- Sigma-Aldrich / Merck
- Corning
- Cytiva / HyClone
- Lonza
- Sartorius
- PAN-Biotech
- Capricorn Scientific
- غلظت
- فرمولاسیون
- منشأ
- حجم
- وجود EDTA
- Phenol Red
هنگام انتخاب تریپسین به چه نکاتی توجه کنیم؟
در مواد کشت سلول، ارزانتر بودن یک محصول لزوماً به معنای اقتصادیتر بودن آن نیست. تکرارپذیری، سازگاری با سلول و کیفیت محصول نیز باید در تصمیم خرید در نظر گرفته شوند.
وکتور چگونه میتواند در تأمین تریپسین کمک کند؟
تریپسین یکی از مواد مصرفی آزمایشگاهی است که ممکن است با برندها، غلظتها و حجمهای مختلف توسط تأمینکنندگان عرضه شود.
در استفاده روزمره از تریپسین، یکی از نکات مهم این است که زمان Trypsinization برای تمام ردههای سلولی یکسان نیست.
برخی سلولها در مدت کوتاهی از سطح جدا میشوند، در حالی که برخی دیگر اتصال قویتری دارند. ادامه دادن Trypsinization صرفاً بر اساس یک زمان ثابت بدون توجه به وضعیت سلولها میتواند باعث Over-Trypsinization شود.
مشاهده سلولها و دنبال کردن پروتکل معتبر همان Cell Line معمولاً اهمیت بیشتری از استفاده از یک زمان ثابت برای تمام سلولها دارد.
همچنین در آزمایشهایی که پروتئینها یا مارکرهای سطح سلول اهمیت دارند، باید اثر روش جداسازی بر Target مورد بررسی در نظر گرفته شود.
سؤالات متداول
منابع
- Freshney RI. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications
- Alberts B, et al. Molecular Biology of the Cell
- ATCC. Animal Cell Culture Guide
- Thermo Fisher Scientific / Gibco. Trypsin and Trypsin-EDTA Technical Documentation
- Merck / Sigma-Aldrich. Trypsin Cell Culture Technical Documentation
- Corning. Cell Culture Technical Resources
- Current Protocols in Cell Biology
- Seabright M. A Rapid Banding Technique for Human Chromosomes. Lancet