تریپسین-EDTA چیست؟
تریپسین-EDTA یکی از پرکاربردترین محلول‌های جداسازی سلول در آزمایشگاه‌های کشت سلولی است و عمدتاً برای جدا کردن سلول‌های چسبنده (Adherent Cells) از سطح فلاسک یا پلیت هنگام پاساژ استفاده می‌شود. Trypsin با هضم کنترل‌شده برخی پروتئین‌های دخیل در اتصال سلولی عمل می‌کند و EDTA با Chelate کردن یون‌هایی مانند کلسیم و منیزیم، اتصال سلول‌ها را تضعیف می‌کند. غلظت Trypsin، مدت زمان تماس، نوع سلول و نحوه متوقف کردن فعالیت آن از عوامل مهم در حفظ Viability و ویژگی‌های سلول هستند.
تریپسین-EDTA چیست؟
کاربرد، نحوه عملکرد و نقش آن در پاساژ سلول‌های چسبنده
- Trypsin-EDTA برای جدا کردن سلول‌های چسبنده از سطح ظروف کشت استفاده می‌شود.
- Trypsin یک آنزیم پروتئولیتیک است و برخی پروتئین‌های اتصال سلولی را تجزیه می‌کند.
- EDTA با اتصال به یون‌های دوظرفیتی مانند Ca²⁺ و Mg²⁺ به کاهش Cell Adhesion کمک می‌کند.
- محلول‌های 0.05% و 0.25% Trypsin-EDTA از فرمولاسیون‌های رایج تجاری هستند، اما انتخاب آن‌ها به نوع سلول و پروتکل بستگی دارد.
- تماس بیش از حد سلول با Trypsin می‌تواند به پروتئین‌های سطحی آسیب بزند و Viability و عملکرد سلول را تحت تأثیر قرار دهد.
تریپسین-EDTA چیست؟
Trypsin-EDTA یک Cell Dissociation Reagent است که برای جدا کردن سلول‌های Adherent از سطح ظروف کشت استفاده می‌شود.
بسیاری از سلول‌ها هنگام رشد در محیط آزمایشگاهی به سطح:
می‌چسبند.
هنگامی که سلول‌ها به تراکم مناسب می‌رسند و قرار است Passage انجام شود، باید این اتصالات به‌صورت کنترل‌شده شکسته شوند.
Trypsin-EDTA یکی از رایج‌ترین مواد برای انجام این کار است.
چرا سلول‌های چسبنده باید از سطح جدا شوند؟
سلول‌های Adherent برای رشد به سطح ظرف کشت متصل می‌شوند.
با تکثیر سلول‌ها، سطح قابل دسترس به‌تدریج پر می‌شود و Confluency افزایش پیدا می‌کند.
اگر سلول‌ها برای مدت نامناسبی در تراکم بالا باقی بمانند، ممکن است:
بنابراین در زمان مناسب، سلول‌ها جدا شده و بخشی از آن‌ها به ظرف جدید منتقل می‌شوند.
این فرآیند Passage یا Subculture نام دارد.
Trypsin چگونه عمل می‌کند؟
Trypsin یک Serine Protease است.
این آنزیم می‌تواند پیوندهای پپتیدی را در برخی پروتئین‌ها هیدرولیز کند.
در Cell Culture، Trypsin روی پروتئین‌هایی که در:
نقش دارند اثر می‌گذارد.
در نتیجه سلول‌ها به‌تدریج اتصال خود را به سطح از دست می‌دهند و می‌توان آن‌ها را جمع‌آوری و به ظروف جدید منتقل کرد.
EDTA چیست و چه نقشی دارد؟
EDTA مخفف Ethylenediaminetetraacetic Acid است.
EDTA یک Chelating Agent است و می‌تواند به یون‌های دوظرفیتی مانند:
متصل شود.
کلسیم و منیزیم در عملکرد بسیاری از مولکول‌های دخیل در Cell Adhesion نقش دارند.
کاهش این یون‌ها می‌تواند اتصالات بین سلول‌ها و سطح را تضعیف کند.
به همین دلیل ترکیب Trypsin و EDTA معمولاً نسبت به استفاده از Trypsin به‌تنهایی Dissociation مؤثرتری ایجاد می‌کند.
چرا Trypsin و EDTA با هم استفاده می‌شوند؟
Trypsin و EDTA از دو مسیر متفاوت به جدا شدن سلول کمک می‌کنند.
ترکیب این دو اثر باعث می‌شود بسیاری از سلول‌های Adherent با شرایط کنترل‌شده از سطح جدا شوند.
Passage سلولی چیست؟
Passage یا Subculture به انتقال بخشی از سلول‌های در حال رشد از یک ظرف کشت به ظرف جدید گفته می‌شود.
برای مثال ممکن است یک Flask به Confluency مناسب رسیده باشد.
سلول‌ها جدا می‌شوند و سپس بخشی از آن‌ها با محیط تازه وارد Flask جدید می‌شوند.
به این ترتیب فضای بیشتری برای رشد سلول‌ها فراهم می‌شود.
تعداد دفعات انجام این فرآیند معمولاً با مفهوم Passage Number ثبت می‌شود.
مراحل کلی Trypsinization
فرآیند دقیق باید بر اساس Cell Line و پروتکل معتبر انجام شود، اما ساختار کلی Passage معمولاً شامل مراحل زیر است:
چرا قبل از Trypsin از PBS استفاده می‌شود؟
یکی از دلایل مهم استفاده از PBS قبل از Trypsinization، حذف باقی‌مانده Serum است.
Serum حاوی پروتئین‌هایی است که می‌توانند فعالیت Trypsin را کاهش دهند.
اگر مقدار زیادی FBS روی سلول باقی مانده باشد، Trypsin ممکن است عملکرد ضعیف‌تری داشته باشد.
به همین دلیل محیط حاوی Serum معمولاً خارج شده و Monolayer طبق پروتکل شسته می‌شود.
چرا PBS بدون کلسیم و منیزیم استفاده می‌شود؟
کلسیم و منیزیم در بسیاری از تعاملات Cell Adhesion نقش دارند.
بنابراین برای آماده‌سازی سلول قبل از Trypsinization معمولاً از PBS without Calcium and Magnesium استفاده می‌شود.
حذف Ca²⁺ و Mg²⁺ می‌تواند اتصال سلول‌ها را کاهش داده و عملکرد EDTA را تسهیل کند.
این موضوع یکی از دلایلی است که هنگام خرید PBS برای Cell Culture باید نوع محصول دقیقاً مشخص شود.
چگونه فعالیت Trypsin متوقف می‌شود؟
Trypsin نباید پس از جدا شدن سلول‌ها برای مدت غیرضروری فعال باقی بماند.
در بسیاری از پروتکل‌های کلاسیک، محیط حاوی Serum به سلول‌ها اضافه می‌شود.
Serum دارای ترکیباتی است که می‌توانند فعالیت Trypsin را مهار کنند.
در سیستم‌های Serum-Free ممکن است از Trypsin Neutralizing Solution یا روش توصیه‌شده برای همان سیستم استفاده شود.
بنابراین روش Neutralization باید با نوع محیط و سلول هماهنگ باشد.
Over-Trypsinization چیست؟
اگر سلول‌ها بیش از حد لازم در معرض Trypsin قرار بگیرند، اصطلاحاً Over-Trypsinization رخ می‌دهد.
این وضعیت می‌تواند باعث:
شود.
به همین دلیل Trypsinization باید تا حد امکان کنترل‌شده انجام شود.
Under-Trypsinization چیست؟
در مقابل، اگر Trypsinization کافی نباشد:
هدف، ایجاد تعادل بین Dissociation کافی و حداقل آسیب سلولی است.
تفاوت Trypsin-EDTA 0.05% و 0.25% چیست؟
Trypsin-EDTA در فرمولاسیون‌های مختلف عرضه می‌شود.
دو غلظت رایج عبارت‌اند از:
محلول 0.25% دارای غلظت بالاتری از Trypsin است، اما این به معنی بهتر بودن آن نیست.
انتخاب غلظت باید بر اساس:
انجام شود.
برخی سلول‌ها با Trypsin ملایم‌تر بهتر کار می‌کنند.
تفاوت Trypsin و Trypsin-EDTA چیست؟
Trypsin به خود آنزیم پروتئولیتیک اشاره دارد.
Trypsin-EDTA علاوه بر Trypsin حاوی EDTA نیز هست.
وجود EDTA باعث کاهش یون‌های Ca²⁺ و Mg²⁺ و تسهیل Dissociation می‌شود.
به همین دلیل Trypsin-EDTA یکی از فرمولاسیون‌های رایج برای Cell Culture است.
تفاوت Trypsin-EDTA و TrypLE چیست؟
TrypLE نام خانواده‌ای از Cell Dissociation Reagentهای Recombinant/Animal-origin-free است که به‌عنوان جایگزین Trypsin در بسیاری از کاربردها استفاده می‌شوند.
| ویژگی | Trypsin-EDTA | TrypLE |
|---|---|---|
| ماهیت | Trypsin-based | Recombinant enzyme |
| کاربرد | Dissociation | Dissociation |
| Animal Origin | بسته به محصول | انواع Animal-origin-free موجود |
| پایداری | وابسته به محصول | معمولاً پایداری مناسب |
| کاربرد در Cell Culture | بسیار گسترده | بسیار گسترده |
| انتخاب | وابسته به Cell Line | وابسته به Cell Line |
در سیستم‌هایی که Animal-Origin Components اهمیت دارند، TrypLE می‌تواند گزینه قابل بررسی باشد.
Trypsin در سلول‌های حساس
همه سلول‌ها نسبت به Trypsin حساسیت یکسانی ندارند.
برخی سلول‌ها ممکن است نسبت به:
حساس‌تر باشند.
برای برخی Primary Cellها یا Stem Cellها ممکن است Cell Dissociation Reagent دیگری توصیه شود.
بنابراین نباید یک Trypsinization Protocol را بدون بررسی برای تمام سلول‌ها استفاده کرد.
Trypsin و Flow Cytometry
یکی از نکات مهم در مطالعات Flow Cytometry این است که Trypsin می‌تواند برخی Surface Proteinها و Antigenها را تحت تأثیر قرار دهد.
اگر قرار است Surface Marker خاصی بررسی شود، باید مشخص شود که Dissociation با Trypsin روی آن Marker اثر دارد یا خیر.
در چنین شرایطی ممکن است استفاده از روش‌های ملایم‌تر Dissociation مناسب‌تر باشد.
Trypsin و Cell Counting
پس از Trypsinization مناسب، هدف معمولاً دستیابی به Cell Suspension نسبتاً یکنواخت است.
سپس می‌توان سلول‌ها را با:
شمارش کرد.
وجود Clumpهای زیاد می‌تواند دقت Cell Counting را کاهش دهد.
بنابراین کیفیت Dissociation روی مراحل بعدی نیز اثر می‌گذارد.
Trypsin و Cell Viability
Trypsinization نامناسب می‌تواند Viability سلول را کاهش دهد.
برای بررسی Viability می‌توان بسته به پروتکل از روش‌هایی مانند:
استفاده کرد.
اگر بعد از Passage به‌طور مکرر Viability پایین باشد، Trypsinization یکی از مراحلی است که باید بررسی شود.
عوامل مؤثر بر Trypsinization
عوامل مختلفی بر سرعت و کیفیت جدا شدن سلول تأثیر دارند:
به همین دلیل زمان Detachment ممکن است حتی برای یک Cell Line در شرایط مختلف متفاوت باشد.
مزایا و محدودیت‌ها
- روش بسیار رایج برای Passage سلول‌های Adherent
- Dissociation مؤثر بسیاری از Cell Lineها
- استفاده آسان
- امکان انتخاب غلظت‌های مختلف
- قیمت نسبتاً مناسب
- سازگاری با بسیاری از پروتکل‌های Cell Culture
- عرضه توسط تولیدکنندگان متعدد
- تماس بیش از حد می‌تواند به سلول آسیب بزند.
- ممکن است برخی Surface Proteinها را تخریب کند.
- برای همه Cell Typeها مناسب نیست.
- زمان Trypsinization به نوع سلول وابسته است.
- باقی‌مانده Serum می‌تواند فعالیت Trypsin را کاهش دهد.
- برای برخی کاربردهای حساس Dissociation Reagentهای دیگری مناسب‌تر هستند.
شرایط نگهداری Trypsin-EDTA
شرایط دقیق نگهداری به محصول بستگی دارد و باید Datasheet سازنده بررسی شود.
موارد مهم شامل:
است.
در صورت نیاز به Aliquot کردن باید این کار تحت شرایط Aseptic انجام شود.
برندهای مطرح Trypsin-EDTA
برخی تولیدکنندگان شناخته‌شده عبارت‌اند از:
محصولات مختلف این شرکت‌ها ممکن است از نظر Trypsin Concentration، EDTA Concentration و فرمولاسیون متفاوت باشند.
هنگام خرید Trypsin-EDTA به چه نکاتی توجه کنیم؟
هنگام استعلام بهتر است فقط عبارت «Trypsin» نوشته نشود.
مشخصات مهم عبارت‌اند از:
برای مثال:
اطلاعات بسیار دقیق‌تری نسبت به عبارت «Trypsin» در اختیار تأمین‌کننده قرار می‌دهد.
وکتور چگونه می‌تواند در تأمین Trypsin-EDTA کمک کند؟
در وکتور می‌توانید درخواست خرید Trypsin-EDTA را با مشخصات دقیق مانند:
ثبت کنید.
سپس پیشنهاد تأمین‌کنندگان مختلف را از نظر:
مقایسه کنید.
همچنین می‌توان محصولات مرتبط مانند PBS، FBS، RPMI 1640، DMEM و Penicillin-Streptomycin را نیز هم‌زمان استعلام کرد.
این موضوع اهمیت دارد، زیرا Trypsin-EDTAهای مختلف الزاماً فرمولاسیون یکسانی ندارند.
یکی از اشتباهات رایج هنگام Passage این است که برای جدا شدن سریع‌تر سلول‌ها، مدت تماس Trypsin بدون توجه به وضعیت سلول افزایش داده شود.
روش بهتر این است که فرآیند Detachment تحت کنترل باشد و وضعیت سلول‌ها بررسی شود.
اگر سلول‌ها به‌طور مداوم دیر جدا می‌شوند، فقط افزایش زمان Trypsin راه‌حل نیست و باید مواردی مانند:
نیز بررسی شوند.
از طرف دیگر، اگر بعد از Passage سلول‌ها دیر به سطح می‌چسبند یا Viability کاهش یافته است، Over-Trypsinization یکی از احتمالات قابل بررسی است.
در Cell Lineهای حساس بهتر است زمان Trypsinization و Passage Number نیز در سوابق کشت ثبت شوند.
سؤالات متداول
منابع
- Freshney RI. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications
- ATCC. Animal Cell Culture Guide
- Current Protocols in Cell Biology
- Thermo Fisher Scientific / Gibco. Trypsin-EDTA Technical Documentation
- Merck / Sigma-Aldrich. Trypsin-EDTA Solution Technical Resources
- Cytiva / HyClone. Cell Dissociation Reagents Technical Documentation
- Corning. Cell Culture and Cell Dissociation Guidelines
- Masters JR, Stacey GN. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols