Whole Exome Sequencing (WES) چیست؟
Whole Exome Sequencing (WES) یا توالییابی کل اگزوم یکی از پرکاربردترین روشهای توالییابی نسل جدید (NGS) است که تمام نواحی کدکننده پروتئین (Exons) ژنوم انسان را بهصورت همزمان بررسی میکند. اگرچه اگزوم تنها حدود ۱ تا ۲ درصد از کل ژنوم را تشکیل میدهد، اما بیش از ۸۵ درصد جهشهای شناختهشده بیماریزا در همین بخش قرار دارند. به همین دلیل WES به یکی از روشهای استاندارد برای تشخیص بیماریهای ژنتیکی، ناهنجاریهای مادرزادی، بیماریهای نادر، اختلالات عصبی، برخی سرطانها و پژوهشهای ژنومی تبدیل شده است. در WES، ابتدا DNA استخراج شده و پس از آمادهسازی کتابخانه (Library Preparation)، نواحی اگزونی با استفاده از پروبهای اختصاصی غنیسازی (Target Enrichment) میشوند. سپس این نواحی توسط دستگاههای NGS توالییابی شده و دادهها با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی تحلیل میشوند.
Whole Exome Sequencing (WES) چیست؟
راهنمای کامل توالییابی کل اگزوم، مراحل انجام، کاربردها و تفاوت آن با WGS
- WES تمام اگزونهای ژنوم را توالییابی میکند.
- فقط حدود ۱ تا ۲ درصد ژنوم بررسی میشود، اما بخش عمده جهشهای بیماریزا را پوشش میدهد.
- برای تشخیص بیماریهای ژنتیکی، بیماریهای نادر، اختلالات عصبی و برخی سرطانها استفاده میشود.
- نسبت به WGS ارزانتر و تحلیل آن سادهتر است.
- برای بررسی واریانتهای خارج از نواحی کدکننده مناسب نیست.
Whole Exome Sequencing (WES) چیست؟
ژنوم انسان حدود ۳.۲ میلیارد جفتباز دارد، اما تنها بخش کوچکی از آن مستقیماً برای ساخت پروتئینها کد میکند. این بخش که اگزوم نام دارد، شامل تمام اگزونهای ژنهای شناختهشده است و حدود ۳۰ تا ۵۰ میلیون جفتباز را در بر میگیرد.
از آنجا که بسیاری از بیماریهای تکژنی ناشی از تغییرات همین نواحی هستند، WES بهجای توالییابی کل ژنوم فقط اگزونها را بررسی میکند. این رویکرد باعث کاهش هزینه، افزایش عمق پوشش و سادهتر شدن تحلیل دادهها میشود.
اگزوم چیست؟
- بخشهایی که پس از پردازش RNA باقی میمانند
- برای ساخت پروتئین ترجمه میشوند
- هدف اصلی WES هستند
- بخشهای غیرکدکننده ژن
- در طی Splicing حذف میشوند
- معمولاً در WES بررسی نمیشوند
WES عمدتاً اگزونها و بخشی از نواحی مجاور آنها، مانند محلهای Splice Site، را هدف قرار میدهد.
WES چگونه کار میکند؟
در WES ابتدا DNA استخراج و کنترل کیفیت میشود. سپس DNA به قطعات کوچک تبدیل شده، آداپتورها به آن متصل میشوند و نواحی اگزونی با پروبهای اختصاصی غنیسازی میشوند. در ادامه، کتابخانه با NGS توالییابی و دادهها تحلیل و تفسیر میشوند.
مراحل انجام WES
- خون محیطی، بزاق یا بافت
- اهمیت بالای کیفیت و خلوص
- NanoDrop
- Qubit
- Bioanalyzer یا TapeStation
- معمولاً ۱۵۰ تا ۳۰۰ جفتباز
- متناسب با پلتفرم توالییابی
- اتصال آداپتورها
- آمادهسازی برای Capture
- پروبهای بیوتینیله
- مهرههای مغناطیسی
- غنیسازی نواحی اگزونی
- بارگذاری روی دستگاه NGS
- خوانش همزمان میلیونها قطعه
- Alignment
- Variant Calling
- Annotation و تفسیر
پارامترهای مهم در WES
- تعداد دفعات خوانده شدن هر باز
- در تشخیص معمولاً حدود 100× یا بیشتر
- درصد نواحی هدف با پوشش کافی
- مثلاً حداقل پوشش 20×
- درصد خوانشهای همتراز
- شاخص مهم کیفیت داده
- درصد خوانشهای تکراری
- اثرگذار بر کیفیت تحلیل
چه واریانتهایی با WES قابل شناسایی هستند؟
چه مواردی معمولاً با WES قابل تشخیص نیستند؟
کاربردهای WES
- علت ناشناخته
- فنوتیپ پیچیده
- چند ناهنجاری همزمان
- تأخیر تکاملی
- صرعهای ژنتیکی
- اختلالات نورودژنراتیو
- ناتوانی ذهنی
- اوتیسم در موارد منتخب
- دیستروفیهای عضلانی
- میوپاتیها
- نوروپاتیهای ارثی
- اختلالات ارثی متابولیسم
- تشخیص مولکولی
- واریانتهای ژرملاین
- پروژههای تحقیقاتی
- برخی کاربردهای بالینی
تحلیل بیوانفورماتیکی WES
طبقهبندی واریانتها
تفاوت WES و WGS
| ویژگی | WES | WGS |
|---|---|---|
| ناحیه بررسی | فقط اگزونها | کل ژنوم |
| درصد ژنوم | ۱–۲٪ | تقریباً ۱۰۰٪ |
| هزینه | کمتر | بیشتر |
| حجم داده | کمتر | بسیار بیشتر |
| تحلیل | سادهتر | پیچیدهتر |
| واریانتهای غیرکدکننده | معمولاً خیر | بله |
| CNVهای بزرگ | محدود | بهتر |
| Structural Variant | محدود | بهتر |
تفاوت WES و Panel Sequencing
| ویژگی | WES | Gene Panel |
|---|---|---|
| تعداد ژن | تقریباً همه ژنهای کدکننده | ژنهای منتخب |
| هزینه | متوسط | کمتر |
| احتمال یافتن ژن جدید | بالا | محدود |
| حجم داده | زیاد | کمتر |
| زمان تحلیل | بیشتر | کمتر |
مزایا و محدودیتهای WES
- پوشش تقریباً تمام ژنهای کدکننده
- مناسب برای بیماریهای ناشناخته
- هزینه کمتر از WGS
- امکان بازتحلیل دادهها با کشف ژنهای جدید
- قدرت تشخیصی بالا در بیماریهای تکژنی
- پوشش نداشتن بیشتر نواحی غیرکدکننده
- حساسیت محدود برای برخی CNVها و Rearrangementها
- نیاز به بیوانفورماتیک پیشرفته
- احتمال یافتن VUS
- امکان وجود نواحی با پوشش ناکافی
عوامل مؤثر بر کیفیت نتایج
کاربرد WES در آزمایشگاههای مختلف
| نوع آزمایشگاه | کاربرد |
|---|---|
| ژنتیک پزشکی | تشخیص بیماریهای ارثی |
| نورولوژی | بیماریهای عصبی ژنتیکی |
| سرطان | مطالعات ژرملاین و تحقیقاتی |
| مراکز تحقیقاتی | کشف ژنهای جدید |
| بیوانفورماتیک | تحلیل دادههای ژنومی |
وکتور چگونه میتواند در راهاندازی بخش WES کمک کند؟
راهاندازی بخش WES به مجموعهای از تجهیزات و مواد مصرفی تخصصی نیاز دارد:
در پروژههای تشخیصی، کیفیت گزارش WES تنها به دستگاه توالییابی وابسته نیست. طراحی مناسب کیت Capture، یکنواختی پوشش، کنترل کیفیت Library Preparation و مهمتر از همه، تفسیر صحیح واریانتها بر اساس فنوتیپ بیمار نقش تعیینکنندهای دارند.
منفی بودن نتیجه WES به معنای رد کامل منشأ ژنتیکی بیماری نیست. ممکن است علت بیماری در نواحی غیرکدکننده، تغییرات ساختاری بزرگ، اختلالات اپیژنتیکی، موزائیسم با فراوانی پایین یا ژنهایی باشد که هنوز ارتباط آنها با بیماری شناخته نشده است.
در چنین مواردی، انجام آزمایشهای تکمیلی مانند WGS، RNA Sequencing، MLPA یا روشهای سیتوژنتیک میتواند ارزشمند باشد.
برندهای مطرح تجهیزات و کیتهای WES
- Illumina
- Element Biosciences
- MGI Tech
- Thermo Fisher Scientific
- Agilent SureSelect Human All Exon
- Twist Human Core Exome
- IDT xGen Exome Research Panel
- Roche SeqCap EZ
- DRAGEN
- GATK
- VarSome
- Franklin by Genoox
- Ensembl VEP
سؤالات متداول
منابع
- ACMG. Standards and Guidelines for Clinical Exome and Genome Sequencing
- Richards S, et al. Standards and Guidelines for the Interpretation of Sequence Variants. Genetics in Medicine
- Rehm HL, et al. ClinGen — The Clinical Genome Resource
- Illumina. Whole Exome Sequencing Overview
- Agilent Technologies. SureSelect Human All Exon User Guide
- Twist Bioscience. Human Exome Panels Technical Documentation